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hpparα配体的HPLC-UV法筛选平台的建立

hPPARα配体的HPLC-UV法筛选平台的建立

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作者：刘华重庆医科大学

学位级别：硕士

目的建立人过氧化物酶体增殖物活化受体alpha(human peroxisome prolifterator-activated receptors alpha,hpparα)配体的HPLC-UV法筛选平台。方法含重组质粒的宿主菌(pMAL-p2X-hppars/TB1)经最佳优化条件诱导后,超声破碎取上清,产物用多糖亲和树脂进行纯化获MBP-hpparsLBD,再用Xa因子酶切、多糖亲和树脂层析和DEAE-52阴离子交换层析纯化回收hpparsLBD。采用HiTrap desalting (SephadexG-25,1.6×2.5cm)色谱柱,柱温8℃,以PBS为流动相,进样量为20μL,洗脱速度为1.0 mL/min。以检测苯扎贝特(Bez)进行方法学考察。然后取40μg hpparαLBD或80μg MBP-hpparαLBD,以Bez为阳性配体, AA为竞争性冷药,反应达平衡后取100μL进样,进行结合反应条件的优化。在优化的反应条件下,取不同浓度的Bez(阳性药)和罗格列酮(Ros)(阴性药)进行结合实验,计算特异性结合(SB)。根据实验结果确立HPLC-UV法筛选hppars配体的判断标准。最后以hpparα的选择性激动剂非诺贝特(Fen)和Bez、hpparγ的选择性激动剂Ros和吡格列酮(Pio)为待试药,检验所建立的HPLC-UV法hppars配体筛选平台的有效性。结果含重组质粒的宿主菌经最佳优化条件诱导,从1L培养物中可获得约20 mg MBP-hpparsLBD。经纯化以及酶切回收,获得了电泳纯的MBP-hpparsLBD和hpparsLBD,其产量分别为14 mg/L和5 mg/L。色谱图中PPARs的保留时间为1.6 min,而Bez的保留时间为6.3min。分离效果较好,柱效高,峰形对称。Bez在0.5-200μmol/L(3.6-1447 ng)范围内线性良好, LOD为0.2μmol/L,,日内、日间RSD均小于5%。MBP-hpparαLBD和hpparαLBD同Bez的结合按照最佳优化条件(25℃孵育40 min pH值分别以8.4和8.00,)反应,SB/TB值均超过了65%。根据分子排阻色谱分离(Molecular Exclusion Chromatography,MEC)理论,取不同浓度的Bez(阳性药)和Ros(阴性药)进行结合实验,确定SB同药物浓度存在量-效关系作为hppars配体的判断标准,建立了HPLC-UV法hpparα配体筛选平台。经检验,该平台能从待试药中有效地筛查出hpparα的阳性配体。获得Bez和Fen的KD值分别为0.91和2.41μmol/L。结论HPLC-UV法筛选hpparα配体是一种简便、有效的受体配体筛选方法。

关键词： MBP hpparα HPLC-UV 配体筛选

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