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hdaxx基因转染抑制地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡

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现代免疫学 2004年第4期24卷 276-278页

作者：刘安元万艳平谭立志吴移谋余敏君南华大学病原生物学研究所衡阳421001

利用真核表达载体pEGFP/hdaxx在巨噬细胞中高表达hdaxx ,研究hdaxx对巨噬细胞凋亡的影响。将pEGFP/hdaxx转染巨噬细胞 ,Westernblot鉴定Daxx的表达 ,荧光显微镜观察GFP hdaxx融合蛋白在细胞内的表达及定位 ,用地塞米松诱导巨噬细胞凋亡 ... 详细信息

利用真核表达载体pEGFP/hdaxx在巨噬细胞中高表达hdaxx ,研究hdaxx对巨噬细胞凋亡的影响。将pEGFP/hdaxx转染巨噬细胞 ,Westernblot鉴定Daxx的表达 ,荧光显微镜观察GFP hdaxx融合蛋白在细胞内的表达及定位 ,用地塞米松诱导巨噬细胞凋亡 ,细胞用Giemsa染色后 ,观察细胞形态变化并计算巨噬细胞凋亡率。结果显示 :GFP hdaxx融合蛋白在巨噬细胞中成功表达并定位于细胞核 ,且GFP hdaxx融合蛋白不影响Daxx的特异性 ;地塞米松对照组与pEGFP对照组凋亡率无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,而pEGFP/hdaxx组凋亡率显著降低 (P hdaxx即时高表达降低地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡率。Daxx为调控蛋白 ,GFP hdaxx融合蛋白在巨噬细胞中表达并定位于细胞核 ,且hdaxx即时高表达可抑制地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡。

关键词： hdaxx 高表达巨噬细胞凋亡

hdaxx的克隆及其与Pin1之间的相互作用

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细胞生物学杂志 2007年第4期29卷 545-549页

作者：陈明谅王继锋贺颖李勤喜叶志云厦门大学生命科学学院教育部细胞生物学与肿瘤细胞工程重点实验室厦门361005

克隆了hdaxx全长的cDNA,并证实hdaxx与肽基脯氨酰异构酶Pin1之间存在相互作用,它们共定位于细胞核内。同时发现它们能够协同激活p53的转录活性,揭示Pin1可能在hdaxx调节细胞凋亡的过程中发挥了重要作用。

关键词： hdaxx Pinl 相互作用

Apoptosis of HeLa cells inhibited by human papillomavirus type 16 E6 protein interacting with hdaxx

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The Chinese-German Journal of Clinical Oncology 2008年第12期7卷 728-731页

作者： Aitao He Xin Wang Cuiming Zhu Hengling Cai Yanping Wan Institute of Pathogenic Biology University of South China Hengyang 421001 China School of Public Health University of South China Hengyang 421001 China

Objective: To study the interaction of human papillomavirus type 16 (HPV16 E6) protein and human death domain associated protein (hdaxx) and its effect on apoptosis of HeLa cells to provide the experimental basis for exploring the oncogenic mechanism of HPV16 E6 protein. Methods: Recombinant vector of pGADT7/E6 or pGBKT7/hdaxx was con- structed. The interaction of E6 protein and hdaxx was detected by yeast two-hybrid system. Their expression in yeast was detected by Western blotting. The eukaryotic plasmids of E6 and hdaxx were co-transfected into HeLa cells. Apoptosis was induced by 5-FU. The apoptotic rate was measured by flow cytometry (FCM). Results: E6 protein had intracellular interaction with hdaxx. The apoptotic rate was rising with the increase in the transfection quantity of pcDNA3.1 (-) / hdaxx in pcDNA3.1 (-) /E6 and pcDNA3.1 (-) / hdaxx co-transfected cells. The difference was significant ( P hdaxx. The over-expression of hdaxx can increase the sensitivity of E6 protein positive HeLa cells to 5-FU. The effect was in a dose dependent manner. HPV16 E6 protein inhibited the apoptosis of HeLa cells by interacting with hdaxx.

关键词： human papillomavirus (HPV) E6 apoptosis hdaxx

腺病毒E1B55kD癌蛋白与hdaxx的相互作用

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中国病毒学 2002年第3期17卷 230-233页

作者：万艳平吴移谋谭立志廖端芳南华大学基础医学院微生物学教研室湖南衡阳421001 南华大学基础医学院药理学教研室湖南衡阳421001

为了探讨腺病毒 (adenovirus,Ad)E1B 5 5kD癌蛋白 (AdE1B 5 5kD)打破hdaxx和PML共定位细胞核的作用机制 ,本文利用体内外共免疫沉淀反应研究AdE1B 5 5kD与hdaxx的结合反应 ,并通过酵母双杂交体系测定两种蛋白质的相互作用及其作用的氨... 详细信息

为了探讨腺病毒 (adenovirus,Ad)E1B 5 5kD癌蛋白 (AdE1B 5 5kD)打破hdaxx和PML共定位细胞核的作用机制 ,本文利用体内外共免疫沉淀反应研究AdE1B 5 5kD与hdaxx的结合反应 ,并通过酵母双杂交体系测定两种蛋白质的相互作用及其作用的氨基酸残基序列。结果显示 :Ad2E1B 5 5kD通过C端 5 8个氨基酸 (aa)与hdaxx结合并发生相互作用。Ad12E1B 5 5kD与hdaxx结合需全序列aa及其构象。共免疫沉淀反应和Westernblot结果证实Ad2 / 5或Ad12E1B 5

关键词：腺病毒 E1B55KD癌蛋白 hdaxx 相互作用

HPV18 E2蛋白与hdaxx在细胞内的共定位及对凋亡的影响

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HPV18 E2蛋白与hDaxx在细胞内的共定位及对凋亡的影响

作者：张琴南华大学

学位级别：硕士

目的: 分析人乳头瘤病毒18型(HPV18)E2蛋白与hdaxx在细胞内的分布与共定位,并初步研究两种蛋白质对凋亡的影响,为进一步探索E2蛋白在HPV 18致癌机制中的作用以及E2防治性疫苗的研制提供实验依据。方法: (1)将质粒pEGFP-C1/E2和pDsRed-M... 详细信息

目的: 分析人乳头瘤病毒18型(HPV18)E2蛋白与hdaxx在细胞内的分布与共定位,并初步研究两种蛋白质对凋亡的影响,为进一步探索E2蛋白在HPV 18致癌机制中的作用以及E2防治性疫苗的研制提供实验依据。方法: (1)将质粒pEGFP-C1/E2和pDsRed-Monomer-C1分别用EcoRI与BamHⅠ双酶切,前者回收小片段约1000bp酶切产物,后者回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化*** JM109 ,筛选阳性克隆,构建Red-HPV18 E2融合蛋白表达载体pDsRed-Monomer-C1/E2。 (2)将质粒pDsRed-Monomer-C1/E2转染HeLa细胞,利用倒置荧光显微镜观察HPV18 E2蛋白在真核细胞中的表达与定位,并通过Western-blot进一步检测其表达。 (3)将质粒pDsRed-Monomer-C1/E2与pEGFP-C1/hdaxx共同转染HeLa细胞,利用激光共聚焦显微镜观察HPV18 E2蛋白与hdaxx的分布,并分析它们的共定位。 (4)将0.5μg与1.0μg pcDNA3.1(-)/hdaxx质粒分别和2.0μg pcDNA3.1(-)/E2质粒瞬时共转染HeLa细胞,设pcDNA3.1(-)转染组和空细胞组作为对照。48h后,分别收集各组细胞,经75%乙醇4℃固定过夜,PI染色后,用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。 (5)将0.5μg与1.0μg pcDNA3.1(-)/hdaxx质粒分别和2.0μg pcDNA3.1(-)/E2质粒瞬时共转染HeLa细胞,设pcDNA3.1(-)转染组和空细胞组作为对照,培养48h后,分别收集各组细胞,按Caspase-8试剂盒说明书操作,用酶标仪测定405nm波长下的吸光度(A值),计算Caspase-8的相对活性。结果: (1)重组质粒经双酶切鉴定,得到目的小片段约1100bp,测序分析所克隆的目的片段与GenBank上公布的HPV18 E2(NC01562)基因序列一致,即构建了pDsRed-Monomer-C1/E2重组体。 (2)真核表达载体pDsRed-Monomer-C1/E2能在HeLa细胞内表达DsRed-HPV18 E2融合蛋白,且主要分布于细胞浆与细胞核。 (3)质粒pEGFP-C1/hdaxx转染的细胞,hdaxx定位细胞核;质粒pEGFP-C1/hdaxx和pDsRed-Monomer-C1/E2共转染细胞,hdaxx在细胞浆与细胞核均有,且绿色与红色荧光重叠为黄色荧光,即HPV18 E2蛋白与hdaxx发生共定位。 ( 4 ) 2μg pcDNA3.1(-)/E2+1.0μg pcDNA3.1(-)/hdaxx组凋亡率明显高于2μg pcDNA3.1(-)/E2+ 0.5μg pcDNA3.1(-)/ hdaxx组,差异具有显著性(Phdaxx组Caspase-8的相对活性高于2μg pcDNA3.1(-)/E2+ 0.5μg pcDNA3.1(-)/ hdaxx组,差异有统计学意义(Phdaxx、pcDNA3.1(-)组及空细胞组,差异有统计学意义(Phdaxx共定位细胞浆与细胞核,且E2蛋白使部分hdaxx从细胞核转位至细胞浆。 (3)HPV18 E2蛋白高表达可促进Caspase-8活化,引起HeLa细胞凋亡;hdaxx能提高该凋亡作用且存在剂量依赖关系。

关键词：人乳头瘤病毒18型(HPV18) E2 hdaxx 定位凋亡

HPV16 E6蛋白与hdaxx的相互作用及其对凋亡的影响

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HPV16 E6蛋白与hDaxx的相互作用及其对凋亡的影响

作者：王鑫南华大学

学位级别：硕士

目的应用酵母双杂交法检测人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6蛋白与hdaxx的相互作用,并初步探讨其相互作用对凋亡的影响,为进一步研究E6蛋白在HPV16致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法⑴pGADT7/E6重组体的构建:采用Primer Premier5.0... 详细信息

目的应用酵母双杂交法检测人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6蛋白与hdaxx的相互作用,并初步探讨其相互作用对凋亡的影响,为进一步研究E6蛋白在HPV16致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法⑴pGADT7/E6重组体的构建:采用Primer Premier5.0软件设计特异性引物,并引入EcoRI和BamHI酶切位点,PCR扩增HPV16 E6基因。用EcoRI和BamHI分别双酶切PCR产物和质粒pGADT7,纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。对重组质粒进行酶切鉴定及序列分析。 ⑵pGBKT7/hdaxx重组体的构建:用EcoRI和SalI分别双酶切pGBDU-C1/hdaxx和pGBKT7,分别纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,筛选到阳性克隆后,对重组质粒行酶切鉴定。 ⑶酵母双杂交检测E6蛋白与hdaxx的相互作用:分4组共转化酵母菌AH109,A组为pGADT7和pGBKT7,B组为pGADT7/E6和pGBKT7/hdaxx,C组为pGADT7/T和pGBKT7/Lam,D组为pGADT7/T和pGBKT7/p53。将转化菌分别接种于SD/-Trp-Leu(二缺陷)固体培养基,30℃培养2～4d,待平板上长出单个菌落后,再将该菌落接种于SD/-Trp-Leu-His(三缺陷)和SD/-Trp-Leu-His-Ade(四缺陷)平板,30℃培养2～4d,观察酵母菌的生长情况。裂解B组四缺陷平板上的酵母菌,提取蛋白质,经Western blot检测E6蛋白和hdaxx在酵母菌中的表达。 ⑷流式细胞术检测凋亡:分别将0μg、10μg、20μg、30μg的pcDNA3.1(-)/hdaxx和10μg pcDAN3.1(-)/E6瞬时共转染Hela细胞,以pcDNA3.1(-)转染组和空细胞组作为对照。5-FU处理36h后分别收集各组细胞,经75%的乙醇4℃固定过夜,PI染色后,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。用统计软件SPSS13.0分析实验数据。结果⑴pGADT7/E6重组体的构建:重组质粒经双酶切及测序分析,所克隆的目的片段与GenBank上公布的HPV16 E6基因(Pubmed NC01526)序列一致。 ⑵pGBKT7/hdaxx重组体的构建:重组质粒经双酶切鉴定,得到了与预期大小一致的约2.2kb的条带。 ⑶E6蛋白和hdaxx相互作用的检测:4个组的二缺陷平板上均可长出白色菌落,但接种到三缺陷和四缺陷平板后,只有B组、D组转化菌可以生长,A组、C组未见菌落生长。提取B组四缺陷平板上的酵母蛋白,经Western blot检测到E6蛋白和hdaxx的表达。 ⑷凋亡率的检测:各组Hela细胞经5-FU处理后,流式细胞术测得,pcDAN3.1(-)/E6转染组细胞凋亡率明显低于pcDNA3.1(-)转染组和空细胞组,结果差异具有统计学意义(Phdaxx的Hela细胞,随pcDNA3.1(-)/hdaxx转染量的增加,凋亡率有所上升。结论⑴成功地构建了pGADT7/E6和pGBKT7/hdaxx酵母菌真核表达载体,并可在酵母菌AH109中表达。 ⑵HPV16 E6与hdaxx在酵母细胞内发生相互作用。 ⑶HPV16 E6蛋白可抑制5-FU诱导的Hela细胞凋亡;在表达E6蛋白的Hela细胞中,hdaxx的过高表达促进5-FU诱导的凋亡。

关键词：人乳头瘤病毒16型(HPV16) E6蛋白 hdaxx 凋亡酵母双杂交

乙型肝炎病毒X蛋白与hdaxx相互作用及对HepG2细胞凋亡的影响

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乙型肝炎病毒X蛋白与hDaxx相互作用及对HepG2细胞凋亡的影响

作者：李金丽南华大学

学位级别：硕士

目的:应用酵母双杂交法检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)与hdaxx的相互作用,并初步探讨其相互作用后对细胞凋亡的影响,为进一步研究HBx在HBV慢性感染致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法: (1)构建酵母菌真核表达载体pGADT7-HBx:... 详细信息

目的:应用酵母双杂交法检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)与hdaxx的相互作用,并初步探讨其相互作用后对细胞凋亡的影响,为进一步研究HBx在HBV慢性感染致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法: (1)构建酵母菌真核表达载体pGADT7-HBx:根据已知的HBV X基因序列,采用Primer Premier5.0软件设计一对引物,并分别引入EcoR I与Xho I酶切位点,PCR扩增X基因;用EcoRI和Xho I分别双酶切PCR产物和质粒pGADT7,分别纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。对重组质粒进行酶切及测序鉴定。 (2)构建酵母菌真核表达载体pGBKT7-hdaxx:用EcoRI和SalI分别双酶切质粒pGBDU-C1/hdaxx和pGBKT7,分别纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,筛选到阳性克隆后,对重组质粒行酶切鉴定。 (3)酵母双杂交检测HBx与hdaxx的相互作用:将酵母菌真核表达载体及酵母菌阴性阳性对照质粒分4组转化酵母菌AH109,A组为pGADT7和pGBKT7、B组为pGADT7-HBx和pGBKT7-hdaxx、C组为pGADT7-T和pGBKT7-Lam、D组为pGADT7-T和pGBKT7-p53,将转化菌落接种于SD/-Trp-Leu(二缺)固体平板,30℃培养2～4d。将单个菌落接种于SD/-Trp-Leu-His(三缺)和SD/-Trp-Leu-His-Ade(四缺)平板,30℃培养2～4d。裂解酵母菌,提取蛋白,经SDS-PAGE、Western blot检测hdaxx和HBx在酵母中的表达。 (4)流式细胞术检测细胞凋亡:将HBV X基因稳定转染入HepG2细胞(即HepG2X),再瞬时转染15μg、30μg和45μg pcDAN3.1-hdaxx,以pcDNA3.1(+)转染HepG2X组和HepG2X组分别作为对照。用10mmol/L的5-氟尿嘧啶(5-FU)处理36h后分别收集各组细胞,经75%的乙醇4℃固定过夜,PI染色后,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。用统计软件SPSS13.0对实验数据进行LSD-t检验分析。结果: (1) PCR扩增HBV X基因片段(465bp),将X基因克隆至pGADT7载体上,经双酶切及测序分析,所克隆的目的片段与已知的X基因序列及GeneBank上公布的HBV X基因(Pubmed NC95551)序列完全一致。 (2)将pGBDU-C1/hdaxx上的hdaxx基因片段亚克隆至pGBKT7载体上,经双酶切分析,得约2.2kb大小的hdaxx基因片段,与预期值大小一致。 (3)分4组转化的酵母菌AH109在二缺陷平板上均可长出白色菌落,但仅有B、D两组菌可以在三缺和四缺平板上生长,选取B组四缺陷平板上单个菌落,提取酵母蛋白, Western blot检测到hdaxx和HBx在同一株酵母菌株中均有表达。 (4)将X基因稳定转染入HepG2细胞,Western blot检测到HBx在HepG2X细胞中的表达。经流式细胞术检测,HepG2细胞用5-FU处理后凋亡率明显高于未经5-FU处理的细胞组,结果具有显著性差异(Phdaxx后,细胞凋亡率进一步降低,但与转染入的pcDAN3.1-hdaxx量没有剂量依赖关系。结论: (1)成功地构建了pGBKT7-hdaxx和pGADT7-HBx酵母菌真核表达载体,并可在酵母菌AH109中表达。 (2) HBx与hdaxx在酵母细胞内存在相互作用。 (3)构建了稳定表达HBx的细胞株HepG2X。 (4) HBx可抑制5-FU诱导的HepG2细胞凋亡,而hdaxx的高表达能提高HBx的抑制作用,使细胞凋亡率进一步降低。

关键词：乙型肝炎病毒 X蛋白 hdaxx 酵母双杂交凋亡

HPV16 E6蛋白与hdaxx在HeLa细胞共定位及对凋亡的影响

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HPV16 E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞共定位及对凋亡的影响

作者：陈苏芳南华大学

学位级别：硕士

目的:分析人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6蛋白与hdaxx在HeLa细胞中的分布与定位,探讨两蛋白高表达对TNF-α诱导HeLa细胞凋亡的影响,为进一步研究E6蛋白在HPV16致癌机制中的作用奠定实验基础。方法:(1)采用脂质体法分别瞬时转染重组质粒pDsRe... 详细信息

目的:分析人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6蛋白与hdaxx在HeLa细胞中的分布与定位,探讨两蛋白高表达对TNF-α诱导HeLa细胞凋亡的影响,为进一步研究E6蛋白在HPV16致癌机制中的作用奠定实验基础。方法:(1)采用脂质体法分别瞬时转染重组质粒pDsRed-Monomer-C1/HPV16 E6或pEGFP-C1/hdaxx,Western blot检测DsRed-HPV16 E6和EGFP-hdaxx融合蛋白在HeLa细胞中的表达。(2)瞬时转染或共转染pDsRed-Monomer-C1/HPV16 E6与pEGFP-C1/hdaxx,激光共聚焦显微镜观察HPV16 E6蛋白与hdaxx在HeLa细胞中的分布,并分析共定位。(3) HPV16 E6与hdaxx真核细胞表达质粒瞬时共转染HeLa细胞,MTT法测定细胞增殖活性。(4)用Hoechst 33258染色细胞核,在荧光显微镜下观察细胞核形态,并对活细胞和凋亡细胞分别计数,计算凋亡率。分别将0μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg pcDNA3.1(-)/hdaxx和2.0μg pcDNA3.1(-)/HPV16 E6瞬时共转染HeLa细胞,以空细胞组、pcDNA3.1(-)转染组和pcDNA3.1(-)/hdaxx转染组作为对照,TNF-α处理12h后分别收集各组细胞,经70%的乙醇4℃固定过夜,PI染色后,用流式细胞术检测凋亡。(5)按(4)法转染HeLa细胞,TNF-α处理细胞12h后,检测caspase-8与caspase-3的相对活性。结果:(1) Western-blot结果显示HPV16 E6和hdaxx重组质粒转染组均出现了免疫反应带,而空质粒转染组和HeLa细胞组未见免疫反应带。(2)在激光共聚焦显微镜下,DsRed-HPV16 E6融合蛋白所发的红色荧光主要分布于胞核,EGFP-hdaxx融合蛋白所发的绿色荧光仅分布于胞核;HPV16 E6和hdaxx共转染组,绿色荧光和红色荧光在胞浆较弱呈均匀分布,在胞核较强且集中分布在核膜附近,红色荧光同绿色荧光融合成黄色荧光。(3)与HPV16 E6转染组比较,HPV16 E6与hdaxx共转染时,细胞增殖活性降低,差异有统计学意义(Phdaxx转染量的增加而升高。(5)与空载体组相比,E6转染组caspase-8和caspase-3两种酶活性均显著降低(Phdaxx转染量增加而升高;当hdaxx为2.0μg时,差异具有统计学意义(Phdaxx融合蛋白能在HeLa细胞内表达,HPV16 E6使部分hdaxx从细胞核转位至细胞浆,且两者发生共定位。(2) HPV16 E6蛋白抑制TNF-α诱导HeLa细胞凋亡;在表达HPV16 E6蛋白的HeLa细胞,hdaxx高表达通过剂量依赖方式促进TNF-α诱导凋亡。(3) HPV16 E6蛋白可抑制caspase-8与caspase-3的活性,hdaxx高表达下调该抑制作用。

关键词：人乳头瘤病毒16型(HPV16) E6蛋白 hdaxx 共定位凋亡 caspase

hdaxx及其删除突变体在酵母菌中的表达及与p53的结合反应

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美国中华临床医学杂志 2002年第3期4卷 191-193页

作者：万艳平吴移谋南华大学微生物学教研室，湖南衡阳421001

目的：研究hdaxx与细胞肿瘤抑制子p53相互作用的结构部位，以便探索两种蛋白质相互作用后的生物学效应，方法：利用pGBDU-C及pGAD-C载体构建Daxx(human Daxx,hdaxx)及其删除突变体（Δhdaxx)酵母菌表达质粒，利用Western blot检测它们... 详细信息

目的：研究hdaxx与细胞肿瘤抑制子p53相互作用的结构部位，以便探索两种蛋白质相互作用后的生物学效应，方法：利用pGBDU-C及pGAD-C载体构建Daxx(human Daxx,hdaxx)及其删除突变体（Δhdaxx)酵母菌表达质粒，利用Western blot检测它们在酵母菌中的表达产物，通过酵母双杂交试验测定hdaxx与p53结合并发生相互作用的结构部位，结果pGBDU-C或pGAD-C/hdaxx与Δhdaxx能在PJ69－4酵母菌株表达目的蛋白，hdaxx及3种Δhdaxx与p53结合并发生相互作用，2种Δhdaxx不与p53结合发生相互作用。结论：hdaxx通过第396－499位氨基酸（aa)或C端241个aa残基与p53发生结合。

关键词：表达结合反应 hdaxx 酵母菌 p53