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可诱导表达hbmp-2的慢病毒载体构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达

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中国修复重建外科杂志 2011年第4期25卷 482-487页

作者：周明石新艳田少奇王丽张积华孙康邢士超孙伟雪黄洪杰吴丹青岛大学医学院附属医院关节外科山东青岛266003 青岛大学医学院附属医院医用材料办公室山东青岛266003 青岛大学医学院附属医院中美干细胞与再生医学中心山东青岛266003 青岛大学医学院附属医院查体中心山东青岛266003 青岛大学医学院附属医院中心实验室山东青岛266003 青岛大学医学院附属医院整形美容烧伤科山东青岛266003

目的构建可诱导表达hbmp-2的慢病毒载体,并研究hbmp-2在人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,HUMSCs)中的可诱导性表达。方法以pcDNA-hbmp-2为模板,通过PCR反应获取hbmp-2,运用GATEWAY技术构建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hbmp-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-反向反式激活因子(reverse transactivator,rtTA),通过PCR鉴定重组慢病毒载体构建。将重组慢病毒与辅助质粒共同转染293FT细胞,包装成能表达hbmp-2的可控性慢病毒,并测定病毒滴度。用病毒转染HUMSCs,使用强力霉素进行诱导,分别在相同诱导时间(48h)不同诱导浓度(0、10、100ng/mL,1、10、100μg/mL)及不同诱导时间(12、24、48、72h)相同诱导浓度(10μg/mL)两种情况下用ELISA法测定hbmp-2的表达情况。对转染前后的HUMSCs进行成骨诱导,用茜素红染色法观察矿化物结节形成情况。结果成功构建了携带hbmp-2的可控性慢病毒载体pLV/EXPN2-Neo-TRE-hbmp-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA,并获得相应的病毒,病毒滴度分别为3.5×108TU/mL和9.5×107TU/mL;病毒转染HUMSCs后,HUMSCs可通过强力霉素的诱导可控性表达hbmp-2。在相同诱导时间情况下,强力霉素10μg/mL时诱导表达最强;而在相同诱导浓度下,hbmp-2的表达在诱导48h达峰值。HUMSCs成骨诱导培养2周后,茜素红染色示胞浆中有大量红色的钙化基质沉积。结论通过GATEWAY技术可以建立携带hbmp-2目的基因的可控性慢病毒载体,为进一步研究hbmp-2诱导HUMSCs成骨分化治疗骨坏死模型奠定实验基础,并提供了一种新的实验思路。

关键词：可诱导慢病毒载体 hbmp-2 Tet-on系统人脐血间充质干细胞强力霉素

鹿瓜多肽联合hbmp-2基因对软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原分泌的影响

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中国老年学杂志 2011年第9期31卷 1577-1580页

作者：王丽红何英徐永柱赖国旗重庆医科大学附属第一医院重庆400016 重庆市卫生信息中心重庆医科大学实验动物中心

目的观察鹿瓜多肽联合hbmp-2基因对软骨细胞的增殖和软骨细胞分泌Ⅱ型胶原是否有协同作用。方法分离培养原代兔软骨细胞,用第3代细胞为模型,实验分为未转染组、腺病毒-绿色荧光蛋白(Ad-GFP)组、Ad-hbmp2-GFP组、鹿瓜多肽+Ad-hbmp2-GFP组... 详细信息

目的观察鹿瓜多肽联合hbmp-2基因对软骨细胞的增殖和软骨细胞分泌Ⅱ型胶原是否有协同作用。方法分离培养原代兔软骨细胞,用第3代细胞为模型,实验分为未转染组、腺病毒-绿色荧光蛋白(Ad-GFP)组、Ad-hbmp2-GFP组、鹿瓜多肽+Ad-hbmp2-GFP组,培养48 h后,RT-PCR检测hbmp-2mRNA的表达,流式细胞仪检测软骨细胞的周期。培养48、72 h后,MTT法检测软骨细胞的增殖,W estern印迹检测hbmp-2蛋白和Ⅱ型胶原的表达。结果培养48 h后,Ad-hbmp2-GFP组和鹿瓜多肽+Ad-hbmp2-GFP组hbmp-2 mRNA呈阳性,而未转染组、Ad-GFP组表达呈阴性;与未转染组、Ad-GFP组、Ad-hbmp2-GFP组比较,鹿瓜多肽+hbmp-2基因组能使软骨细胞S-G2/M期细胞比例增加,软骨细胞数量增加(Phbmp-2蛋白表达和Ⅱ型胶原分泌增加(P2 h比较,鹿瓜多肽联合hbmp-2基因对软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原分泌无显著性差异(P>0.05)。结论鹿瓜多肽能促进hbmp-2基因在软骨细胞中合成hbmp-2蛋白,鹿瓜多肽联合hbmp-2基因对软骨细胞增殖和分泌Ⅱ型胶原的功能有协同作用。

关键词：鹿瓜多肽 hbmp-2 软骨细胞增殖 Ⅱ型胶原

hbmp-2基因联合鹿瓜多肽对软骨细胞生长及分泌功能影响的实验研究

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hBMP-2基因联合鹿瓜多肽对软骨细胞生长及分泌功能影响的实验研究

作者：王丽红重庆医科大学

学位级别：硕士

背景和目的当今软骨组织工程和基因治疗已成为骨关节炎软骨修复治疗的研究热点,其中如何获得大量有功能的软骨种子细胞已成为制约组织工程构建软骨的瓶颈。本实验研究将hbmp-2基因体外转染兔软骨细胞,在转染体系中加入鹿瓜多肽联... 详细信息

背景和目的当今软骨组织工程和基因治疗已成为骨关节炎软骨修复治疗的研究热点,其中如何获得大量有功能的软骨种子细胞已成为制约组织工程构建软骨的瓶颈。本实验研究将hbmp-2基因体外转染兔软骨细胞,在转染体系中加入鹿瓜多肽联合培养,观察二者对软骨细胞增殖及分泌Ⅱ型胶原功能的影响,试图为获得大量功能良好的软骨种子细胞寻找新的方向,也为hbmp-2基因和鹿瓜多肽注射液用于临床治疗骨、软骨破坏性疾病进一步提供理论依据。方法 1.实验分组:未转染组、空病毒（Ad-GFP）组、Ad- hbmp-2–GFP组、鹿瓜多肽+Ad–hbmp-2–GFP组 2.人胚肾293细胞包装hbmp-2–GFP腺病毒载体,病毒扩增及病毒滴度测定。 3.分离培养、鉴定原代兔软骨细胞,用第三代细胞为模型,通过基因转染技术,转染hbmp-2至兔软骨细胞48h后,用RT-PCR检测hbmp-2 mRNA的表达,细胞免疫荧光法和Western- Blot检测软骨细胞中hbmp-2蛋白的表达和Ⅱ型胶原的表达,用未转染组和空病毒（Ad-GFP）组做对照。 4.鹿瓜多肽作用于软骨细胞24h、48h、72h后,用MTT法筛选最佳药物浓度和时间。 5.培养48h后,用流式细胞仪检测软骨细胞生长周期;培养48h、72h后,MTT法检测软骨细胞的增殖, Western blot检测hbmp-2蛋白和Ⅱ型胶原的表达。 6.统计学方法:采用SPSS16.0统计软件分析,所有数据均用均数±标准差表示（（x|-）±s）,采用单因素方差分析,组间差异比较用q检验,P＜ 0.05差异具有统计学意义。结果 1.通过感染293细胞后,测得Ad-hbmp2-GFP滴度为2×106PFU/ml。 2.转染48h后,hbmp-2基因转染组可见hbmp-2mRNA表达,细胞胞浆可见红色荧光表达,胞核无表达,未转染组和空病毒组呈阴性,;转染48h、72h后,比较hbmp-2蛋白和Ⅱ型胶原的表达量,hbmp-2转染组较空病毒转染组灰度值增加。 3.鹿瓜多肽4~32ug/ml浓度作用于软骨细胞24h~72h时具有促进软骨细胞增殖作用,以8ug/ml作用48h后作用最明显。 ***-2基因联合鹿瓜多肽作用于软骨细胞48h后,流式细胞仪检测软骨细胞生长周期结果发现,二者能使软骨细胞进入S-G2/M期细胞比例增加;促进软骨细胞增殖;使软骨细胞hbmp-2蛋白表达和Ⅱ型胶原分泌增加。结论腺病毒介导hbmp-2基因能有效转染体外培养的兔软骨细胞,在基因转染的培养体系中加入8ug/ml鹿瓜多肽联合培养,作用48h后二者能协同促进软骨细胞增殖和分泌Ⅱ型胶原的能力,使软骨细胞在体外培养过程中能够大量增殖和维持良好的生物学特征。本实验为软骨组织工程获得大量软骨种子细胞提供了新的方向。

关键词：鹿瓜多肽 hbmp-2 软骨细胞 Ⅱ型胶原

hbmp-2基因转染骨髓基质干细胞治疗兔股骨头缺血性坏死

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hBMP-2基因转染骨髓基质干细胞治疗兔股骨头缺血性坏死

作者：毛瑞军延边大学

学位级别：硕士

目的：检测hbmp-2腺病毒(rAAV2-hbmp-2)转染的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的转染效率及转染后的基因表达,探讨转染后BMSCs (?)的生物学特性。研究hbmp-2基因转染的BMSCs在治疗股骨头缺血性坏死中的作用及价值。方法：双侧股骨外侧髁和胫骨... 详细信息

目的：检测hbmp-2腺病毒(rAAV2-hbmp-2)转染的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的转染效率及转染后的基因表达,探讨转染后BMSCs (?)的生物学特性。研究hbmp-2基因转染的BMSCs在治疗股骨头缺血性坏死中的作用及价值。方法：双侧股骨外侧髁和胫骨近端穿刺获取成年新西兰白兔(6月龄,体重2.0-2.5Kg)骨髓,应用密度梯度离心的方法分离兔BMSCs并扩增,加入10ml的1640(含10%的胎牛血清)进行培养。观察细胞形态和生长情况,碱性磷酸酶染色检测BMSCs的成骨能力。研究兔BMSCs的成骨潜能。完成腺相关病毒介导hbmp-2 (rAAV2-hbmp-2)制备,以rAAV2-hbmp-2转染兔BMSCs,在细胞80%汇合后行病毒转染过夜,感染倍率为105v. g./cell。收获转染后24h-6d的转染上清,应用Western blot方法检测转染BMSCs中外源hbmp-2基因的转录与表达。36只新西兰白兔建立液氮即刻冷冻股骨头缺血性坏死模型,根据不同移植物随机分为3组,每组12只,A组为空白骨坏死对照组,B组为单纯BMSCs植入组,C组hbmp-2转染BMSCs植入组。造模证实成功后,C型臂监视下,将生理盐水、BMSCs、hbmp-2转染的BMSCs分别植入A、B、C三组骨坏死区域,每组兔分别在术后2、4、8周行影像学检测后处死4只,取下股骨头标本检测。结果：在原代培养中,第4d首次换液,可见少量成纤维细胞样细胞贴壁于培养瓶底,并有少数克隆形成,即来源于成纤维细胞克隆形成单位。第7-10d,克隆逐渐增多、增大,形成直径5mm-8mm的较大克隆和hbmp-2基因转染的兔BMSCs可有效表达hbmp-2,其分泌于培养上清中的蛋白产物可促进兔的成骨细胞增值并增加成骨细胞的活性。组织形态学检测发现C组在植入后4周有明显成骨表现,植入后8W时坏死区被完全修复;B组经检测只有较少新骨形成,8周时坏死区多为纤维样组织,C组新骨体积明显大于B组。造模后8周A组股骨头发生塌陷;植入后8周B组股骨头内存在囊状密度减低区;至12周C组股骨头形态规则,未发生塌陷。结论：hbmp-2基因转染的兔BMSCs可有效表达具有生物活性的hbmp-2蛋白,培养上清液中可检测到高水平表达具有成骨能力的hbmp-2蛋白,为以hbmp-2基因和BMSCs为基础的基因治疗在ONFH修复与再造中应用提供了实验基础。hbmp-2基因转染的兔BMSCs治疗兔ONFH较单纯BMSCs有更好的疗效。

关键词： hbmp-2 股骨头缺血性坏死骨髓基充质干细胞转染

Ad—hbmp-2基因修饰对兔脂肪干细胞向成骨细胞分化的影响

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中华创伤杂志 2007年第2期23卷 147-149页

作者：方忠李锋游洪波熊伟李光辉华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科武汉430030

2001年，Zuk等首次报告从人体脂肪组织提取物（processed lipoaspirate，PLA）中发现有一群具有向多种组织分化潜能的多能干细胞，称之为脂肪干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）；并成功地在体外增殖、分化。目前已证实，AD... 详细信息

2001年，Zuk等首次报告从人体脂肪组织提取物（processed lipoaspirate，PLA）中发现有一群具有向多种组织分化潜能的多能干细胞，称之为脂肪干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）；并成功地在体外增殖、分化。目前已证实，ADSCs在外来生长因子的诱导下可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌源性细胞等多种组织细胞；骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,

关键词：成骨细胞分化脂肪干细胞 hbmp-2 基因修饰骨形态发生蛋白组织提取物 Ad 多能干细胞

Ad-hbmp-2转染体外培养人退变腰椎间盘细胞的研究

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中国矫形外科杂志 2005年第17期13卷 1331-1333页

作者：顾海伦吕刚李建军刘莉黄涛原泉中国医科大学第一临床学院骨科沈阳110001 中国医科大学第二临床学院骨科中国医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室

[目的]研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-hbmp-2)转染体外培养人退变腰椎间盘细胞,分析其对腰椎间盘细胞影响。[方法]成人退变腰椎间盘细胞体外培养,通过免疫组化和染色体分析鉴定椎间盘细胞。利用免疫荧光和蛋白印迹法检测不... 详细信息

[目的]研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-hbmp-2)转染体外培养人退变腰椎间盘细胞,分析其对腰椎间盘细胞影响。[方法]成人退变腰椎间盘细胞体外培养,通过免疫组化和染色体分析鉴定椎间盘细胞。利用免疫荧光和蛋白印迹法检测不同转染剂量对细胞BMP-2表达的影响。[结果]体外培养成人退变腰椎间盘细胞第2代鉴定具有其结构功能。转染后通过免疫荧光和蛋白印迹法可见随转染剂量增加BMP-2表达量逐渐增加。[结论]Ad-hbmp-2可高效转染体外培养人退变椎间盘细胞,同时随转染剂量增加BMP-2表达量逐渐增加。

关键词：腺病毒骨形态蛋白2 椎间盘细胞基因转染退变椎间盘细胞退变腰椎间盘细胞体外培养转染 hbmp-2 蛋白印迹法

携带hbmp-2的tet-on慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞及hbmp-2的体外表达

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携带hBMP-2的tet-on慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞及Hbmp-2的...

作者：周明青岛大学

学位级别：硕士

目的：研究携带hbmp-2的tet-on慢病毒载体对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs）的转染及转染后hbmp-2在强力霉素诱导下的表达情况。方法：按照文献方法培养人脐带间充质干细胞,消化传代,... 详细信息

目的：研究携带hbmp-2的tet-on慢病毒载体对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs）的转染及转染后hbmp-2在强力霉素诱导下的表达情况。方法：按照文献方法培养人脐带间充质干细胞,消化传代,转染前一天,选取3.4代生长状态良好的HUCMSCs按照融合度40%接种到六孔板中,第二天进行pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA、pLV/EXPN2-Neo-TRE-hbmp2共转染,转染后8h更换培养液。待培养24h之后用嘌呤霉素和G418进行稳定筛选。提取DNA进行PCR检测,确定基因是否已成功转入。选取稳定筛选后的脐带间充质干细胞,分别在不同强力霉素诱导浓度相同诱导时间和不同诱导时间相同强力霉素诱导浓度情况下用ELISA测定hbmp-2的表达情况。。对转染前后的HUMSCs进行成骨诱导,用茜素红染色法观察矿化物结节形成情况。结果：携带hbmp-2的tet-on慢病毒载体可成功转染人脐带间充质干细胞,且HUCMSCs可以通过强力霉素的诱导可控性表达hbmp-2。在相同诱导时间情况下,强力霉素10μg/ml时诱导表达最强,而在相同诱导浓度下,hbmp-2的表达在诱导48h后达峰值。HUCMSCs成骨诱导培养2周后,茜素红染色示细胞浆中有大量红色的钙化基质沉积。结论：携带hbmp-2的tet-on慢病毒载体成功转染人脐带间充质干细胞,并初步研究了hbmp-2在体外强力霉素诱导下的表达情况。为进一步研究hbmp-2诱导HUCMSCs成骨分化治疗骨坏死模型奠定实验基础,并提供了一种新的实验思路。

关键词：可诱导慢病毒人脐带间充质干细胞 hbmp-2 tet-on系统强力霉素

hbmp-2基因转染骨髓基质细胞及效果检测

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解剖科学进展 2004年第2期10卷 136-139,143页

作者：郑德宇秦书俭郑国顺姚素艳锦州医学院解剖学教研室辽宁锦州121001 锦州医学院卫生所辽宁锦州121001 锦州医学院药理学教研室辽宁锦州121001

目的　通过观察转染hbmp 2基因在骨髓基质细胞生物学性状变化和检测hbmp 2基因在受体细胞中表达水平 ,探讨骨髓基质细胞作为hbmp 2基因受体细胞的可行性。方法　应用脂质体介导的方法将携带hbmp 2基因的重组载体PcDNA3 hbmp2导入体外培... 详细信息

目的　通过观察转染hbmp 2基因在骨髓基质细胞生物学性状变化和检测hbmp 2基因在受体细胞中表达水平 ,探讨骨髓基质细胞作为hbmp 2基因受体细胞的可行性。方法　应用脂质体介导的方法将携带hbmp 2基因的重组载体PcDNA3 hbmp2导入体外培养的骨髓基质细胞中 ,用G4 18筛选获得阳性细胞 ,分别应用PCR技术、原位杂交技术和ELISA检测目的基因DNA、mRNA和蛋白质的存在与表达状况 ,并绘制细胞的生长曲线。结果　PCR方法显示实验组可见约 36 0bp的基因条带 ,原位杂交方法显示实验组约有 15～ 2 0 %的阳性细胞 ,ELISA方法显示培养第 1～ 4天时hbmp 2的含量为 37ng/3× 10 5细胞 ,培养第 11～14天和第 2 5～ 2 8天均约 5 4ng/3× 10 5细胞。转染后阳性细胞的倍增时间和生长时间没有因为目的基因的导入而改变 ,与正常培养的细胞相比差异不显著。结论　骨髓基质细胞可以作为hbmp 2基因的受体细胞 ,基因表达可分泌hbmp 2蛋白质 ,可作为骨组织工程学中的种子细胞。

关键词： hbmp-2 基因转染骨髓基质细胞检测种子细胞骨缺损

hbmp-2转染自体兔骨髓基质细胞附和异体兔脱钙骨基质的成骨实验研究

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骨与关节损伤杂志 2004年第7期19卷 462-464页

作者：李军范德刚范清宇俞兰张殿忠第四军医大学唐都医院全军骨科中心西安市710038

目的　探讨人骨发生蛋白 2 (hbmp - 2 )转染兔自体骨髓基质细胞 (rMSCs)的骨生成诱导作用以及附和异体兔脱钙骨基质 (DBM )后的成骨效能。方法　取兔自体骨髓基质细胞培养扩增 ,用脂质体介导的方法转染人骨发生蛋白 2基因 ,将转染和未... 详细信息

目的　探讨人骨发生蛋白 2 (hbmp - 2 )转染兔自体骨髓基质细胞 (rMSCs)的骨生成诱导作用以及附和异体兔脱钙骨基质 (DBM )后的成骨效能。方法　取兔自体骨髓基质细胞培养扩增 ,用脂质体介导的方法转染人骨发生蛋白 2基因 ,将转染和未转染人骨发生蛋白 2基因的自体骨髓基质细胞附和于异体兔脱钙骨基质形成新的生物植骨材料 ,连同空白及单纯脱钙骨基质对照组植入兔前肢肌袋和桡骨缺损。 2、 4、 6、 8周分别取材进行大体、放射线和病理观察。结果　肌袋试验 6周后 ,转染人骨发生蛋白 2基因的自体骨髓基质细胞附和异体兔脱钙骨基质材料中出现骨组织细胞 ,未转染组和单纯异体兔脱钙骨基质组为纤维组织。骨缺损试验中 ,三组均能产生骨的形成和缺损的修复 ,但仍然是转染复合材料组的骨修复再生能力最大。结论　局部应用hbmp -

关键词： hbmp-2转染兔骨髓基质细胞脱钙骨成骨实验 hbmp-2 rMSCs 骨组织细胞