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青鳉tsn的克隆与表达分析

上海海洋大学学报 2022年第1期31卷 11-18页

作者：汪丝雨郭海燕李茜廖敏李雅园关桂君上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室上海201306 上海海洋大学国家海洋生物科学国际联合研究中心上海201306 上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306

有性繁殖的性别决定机制虽具有多样性,但其生殖细胞都经过几轮有丝分裂和增殖后进入减数分裂,最终产生雌性或雄性配子。尽管有丝分裂过程中的生殖细胞在形态上没有雌雄差异,然而,未分化的生殖细胞在有丝分裂过程中如何获得雌雄性别特征... 详细信息

有性繁殖的性别决定机制虽具有多样性,但其生殖细胞都经过几轮有丝分裂和增殖后进入减数分裂,最终产生雌性或雄性配子。尽管有丝分裂过程中的生殖细胞在形态上没有雌雄差异,然而,未分化的生殖细胞在有丝分裂过程中如何获得雌雄性别特征尚不清楚。青鳉(Oryzias latipes)正常XX卵巢、正常XY精巢以及性腺体细胞衍生因子(gonadal soma-derived factor,gsdf)缺失型(gsdf^(-/-))卵巢的蛋白质组学质谱比对分析结果显示,gsdf^(-/-)XY卵巢中Tsn(Translin)蛋白产物显著高于gsdf^(-/-)XX卵巢,提示Tsn蛋白表达可能受dmy(DM-domain on Y chromosome,又名dmrt1bY)及下游gsdf雄性信号调控。从青鳉性腺组织的cDNA中克隆了tsn基因的ORF(Open Reading Frame)片段。氨基酸序列的同源性比对分析及系统发育树评估显示,Tsn在脊椎动物物种间具有进化保守性,青鳉和斑马鱼(Danio rerio)的Tsn氨基酸序列高度同源。反转录PCR和实时荧光定量PCR检测结果显示,tsn的mRNA在野生型青鳉多个组织中广泛表达,其中在精巢中的表达量显著高于卵巢。免疫荧光检测发现,gsdf^(-/-)XY卵巢中抗青鳉Tsn抗体阳性反应的囊性生殖细胞异常增多,同蛋白组学分析得到的gsdf^(-/-)XY卵巢中Tsn蛋白表达量高于gsdf^(-/-)XX卵巢的结果相一致。在青鳉性腺分化发育过程中,gsdf信号可能抑制Tsn阳性的雄性囊性生殖细胞增殖,当该信号被破坏后,这种抑制作用消失,导致Tsn阳性生殖细胞在gsdf^(-/-)XY卵巢中大量积累。青鳉Tsn阳性生殖细胞的囊性增殖,是青鳉有丝分裂期生殖细胞雄性分化的特征之一,为脊椎动物有丝分裂期生殖细胞的雌雄性别鉴定提供了线索。

关键词： gsdf tsn 生殖细胞性别分化卵巢青鳉

青鳉gsdf调控ddx6介导的卵子发生的潜在机制

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基因组学与应用生物学 2022年第11期41卷 2099-2110页

作者：李茜王光幸李新闻关桂君上海海洋大学水产与生命学院上海201306

性腺体细胞衍生因子(gonadal soma-derived factor,gsdf)是青鳉(Oryzias latipes)雄性性别分化启动的开关因子之一,敲除gsdf将导致生殖细胞过度增殖以及XY雄鱼性逆转为雌鱼。本研究通过蛋白质组学对比分析青鳉野生型XX卵巢与gsdf缺失型X... 详细信息

性腺体细胞衍生因子(gonadal soma-derived factor,gsdf)是青鳉(Oryzias latipes)雄性性别分化启动的开关因子之一,敲除gsdf将导致生殖细胞过度增殖以及XY雄鱼性逆转为雌鱼。本研究通过蛋白质组学对比分析青鳉野生型XX卵巢与gsdf缺失型XY卵巢,发现有60个差异表达蛋白(differentially expressed proteins,DEPs)上调,158个DEPs下调。GO(Gene ontology)功能富集到细胞间桥、脂质转运等细胞连接结构和能量代谢通路,KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集到RNA降解等关键信号通路,并发现DEAD-box解旋酶6(DEAD-box helicase 6,DDX6)蛋白表达量在gsdf敲除卵巢中显著升高,其mRNA的表达在转录组学分析中呈现相同增加趋势。各物种DDX6的分子结构具有高度同源性和进化保守性,RT-qPCR显示母源性ddx6 mRNA的表达随着青鳉胚胎的发育而减弱,在成体精巢与卵巢组织中均呈现高表达的特征,说明DDX6在配子发生和性腺分化发育过程中发挥重要作用。根据蛋白互作网络与组学分析结果,推测gsdf通过调控RNA降解(含有ddx6、lsm1等基因)途径抑制生殖细胞增殖,影响P-bodies(Cytoplasmic processing bodies)的组装,从而阻断了生殖细胞雌性分化。而卵黄原蛋白在gsdf缺失卵巢中的表达异常降低,这与敲除后卵母细胞大量停止在卵黄发生前的初级卵母细胞阶段的现象一致,说明gsdf可能通过DDX6介导参与初级卵泡发生和卵母细胞的发育过程。本实验研究结果为脊椎动物生殖细胞性别分化初期的分子机制研究提供了新的见解。

关键词：蛋白质组学 gsdf ddx6 性别分化青鳉

Genome Editing in the Olive Flounder(Paralichthys olivaceus)Using CRISPR/Cas9 and a Simple Microinjection System

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Journal of Ocean University of China 2021年第6期20卷 1528-1536页

作者： TAN Xungang WANG Ling WU Zhihao JIAO Shuang WANG Lijuan ZOU Yuxia JIANG Jingteng YOU Feng CAS and Shandong Province Key Laboratory of Experimental Marine Biology Center for Ocean Mega-ScienceInstitute of OceanologyChinese Academy of SciencesQingdao 266071China Laboratory for Marine Biology and Biotechnology Qingdao National Laboratory for Marine Science and TechnologyQingdao 266071China University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China Weihai Fishery Technology Promotion Station Weihai 264200China Shenghang Aquatic Science and Technology Co. Ltd.Weihai 264200China

The whole-genome sequence of the olive flounder(Paralichthys olivaceus)provides a basis for gene functional analyses,which is important for the aquaculture industry.Understanding gene function will help us to select better economic traits such as fast growth and better culture conditions,which further will increase the aquaculture output.Gene knockout is an important reverse genetics approach for in vivo studies of gene function.In this study,the CRISPR/Cas9 genome editing method with a microinjection system using a simple braked needle was employed in olive flounder.After injection in embryos,green fluorescent protein expression was detected in 40%of larvae.The proportion of normal-hatched larvae was approximately 50%.Different mutations,including short indels and fragment deletions,were found in our test genes gsdf and myomaker.Additionally,we detected more than one mutation in a single larva.In summary,our microinjection technique and CRISPR/Cas9 can be applied to study gene functions in olive flounder.

关键词： CRISPR/Cas9 gsdf microinjection myomaker needle with brake olive flounder

青鳉nup58和nop58的表达及其在性别分化中的潜在作用

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青鳉nup58和nop58的表达及其在性别分化中的潜在作用

作者：李雅园上海海洋大学

学位级别：硕士

与哺乳动物一样,青鳉(Oryzias latipes)雄性由XY性别系统决定,因其具有繁殖快、易饲养、基因组小等优点,所以青鳉可作为研究脊椎动物生殖细胞增殖与性分化的生物模型。性腺体细胞衍生因子(gonadal soma-derived factor,gsdf)能调控青鳉... 详细信息

与哺乳动物一样,青鳉(Oryzias latipes)雄性由XY性别系统决定,因其具有繁殖快、易饲养、基因组小等优点,所以青鳉可作为研究脊椎动物生殖细胞增殖与性分化的生物模型。性腺体细胞衍生因子(gonadal soma-derived factor,gsdf)能调控青鳉雄性生殖细胞,并在有丝分裂最后一轮之前开启或关闭配子发生中起着关键作用。同时,在青鳉中敲除gsdf会导致雄鱼性反转成雌鱼,还会出现精原细胞大量增殖、中心体复制异常、生殖细胞在粗线期滞留和囊性增殖不同步的现象。本研究是对gsdf调控性别分化机制的补充和完善。核孔复合体是物质进出核质/胞质的通道。核孔蛋白可以调节RNA及蛋白质进出核孔的运输效率,从而调节基因的表达,即使这种调节只是微妙的变化,但也可能对细胞信号和细胞命运产生戏剧性影响。核孔蛋白58(Nucleoporin 58,Nup58)是核孔复合物中央通道的组成成员之一,对果蝇雄性生殖细胞进入减数分裂十分重要,并且可能是人类精子发生所必须的。本实验通过分析nup58基因在野生型青鳉的表达模式,发现nup58在青鳉各时期及各组织中均有表达,并且在精巢中的表达高于卵巢。雌鱼中nup58基因启动子的整体甲基化水平为5.55%,雄鱼为2.96%,但这种差异并不显著,表明nup58基因在青鳉雌雄性腺中的表达差异受启动子甲基化的调控不显著。对gsdf和gsdf青鳉精巢转录组数据分析发现,在所有核孔蛋白基因中nup58基因在gsdf敲除后精巢中的表达升高最显著,这一显著差异得到了RT-q PCR的验证。另外,上调差异基因KEGG通路有富集到核质转运通路,nup58基因也在此通路中,提示nup58的表达可能受gsdf信号及下游Smad磷酸化去磷酸化信号转导通路的调控。免疫荧光实验结果显示,Nup58在gsdf和gsdf青鳉性腺配子发生的不同阶段的所有生殖细胞中都有表达,且在卵巢中的表达定位会随核膜的变化发生变化。通过透射电镜对gsdf和gsdf青鳉精巢进行观察,发现gsdf敲除后粗线期精母细胞的细胞核膜发生凹陷且有提前发生破裂的可能,而这种变化可能是由于gsdf敲除后nup58含量的增加导致核膜上核孔复合体变大所引起的。最后,PCMV-N-FLAG-Nup58重组载体在293T细胞中的正确表达将为后续开展细胞实验打下良好基础。本研究显示Nup58作为一种核孔蛋白,同青鳉雄性生殖细胞的增殖密切关联,并且其在gsdf信号缺失精巢中的高表达同生殖细胞的异常囊性增殖呈正相关关系。由Nup58核孔蛋白协调的核质运输在生殖细胞性别分化中的作用和动态变化,值得进一步探讨。核仁不仅是产生核糖体RNA和组装核糖体亚基的地方,也是许多减数分裂基因的定位场所。核仁蛋白58(Nucleolar protein 58)是sno RNA稳定或合成所必需的,关于Nop58蛋白的研究集中于肿瘤方面,而在性别分化方面的研究未经报道。我们前期的实验结果表明Nop58蛋白在gsdf敲除卵巢中的表达显著上调,这表明Nop58除了在肿瘤发生中的作用外,在鱼类配子发生和性分化中也具有潜在的作用。同时,His-tag“下拉”实验结合鸟枪式LC-MS/MS报告了一批gsdf的潜在相互作用伙伴,发现Nop58是gsdf的潜在伴侣之一。本研究首先通过RT-q PCR实验对nop58基因在青鳉各组织及各时期中的表达模式进行探究,发现其在青鳉的不同时空中均能表达,并且其在精巢中表达会显著高于卵巢。而gsdf和Nop58之间的相互作用也被配对酵母双杂交实验证实。综上,Nop58可能通过与gsdf相互作用在配子发生中发挥作用,这为核仁参与性别分化过程提供了新的线索和见解。

关键词：青鳉 nup58 nop58 gsdf 性腺性别分化

青鳉gsdf调控cyp19b介导的脑垂体性腺轴性别分化

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基因组学与应用生物学 2020年第10期39卷 4491-4499页

作者：亢逸徐疏梅张颖庆陈良标关桂君上海海洋大学水产与生命学院水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室农业部淡水水产种质资源重点实验室上海201306 上海海洋大学中国科学技术部海洋生物科学国际联合研究中心上海201306

芳香化酶是雄激素转化为雌激素重要的限速酶,在硬骨鱼中有卵巢型(Cyp19a)和脑型芳香化酶(Cyp19b)两种。cyp19a敲除的XX性腺能产生初级卵母细胞,证明生殖细胞早期雌性分化不受cyp19a影响,而cyp19b在性腺分化及发育成熟过程中的生理作用... 详细信息

芳香化酶是雄激素转化为雌激素重要的限速酶,在硬骨鱼中有卵巢型(Cyp19a)和脑型芳香化酶(Cyp19b)两种。cyp19a敲除的XX性腺能产生初级卵母细胞,证明生殖细胞早期雌性分化不受cyp19a影响,而cyp19b在性腺分化及发育成熟过程中的生理作用尚不清楚。利用免疫组化和实时荧光定量的方法,发现cyp19b在垂体和性腺中都有表达,且伴随着发育,其表达量的差异主要集中在垂体上。雌性垂体的Cyp19b蛋白质水平明显高于雄性垂体,而性腺中的mRNA表达无明显性差。垂体促黄体生成素Lh分泌细胞数量也在性成熟期的雌性中高于雄性。然而gsdf缺失突变体雌性垂体中Cyp19b和Lh表达量均下降,表明gsdf信号可能影响了Cyp19b和Lh的表达,该结果为TGF-β调节垂体性腺轴的发育提供了新的见解。定量PCR结果显示,成熟期正常精巢的lhr(Luteinizing hormone receptor)表达量高于正常XX卵巢和gsdf敲除的XY卵巢。gsdf过表达的XX精巢中cyp9b和lhr的转录水平均明显上升。以上结果揭示gsdf信号可能直接或间接调控cyp19b和lhr在性腺-垂体轴中的表达,进而影响雄激素转化雌激素的合成。gsdf敲除型青鳉,为深入探索性腺-垂体轴cyp19b和lh调控卵细胞的发生发育分子机制,提供了好的研究平台。

关键词： cyp19b gsdf 性激素垂体- 性腺轴 lh

gsdf基因启动子驱动硝基还原酶表达的转基因斑马鱼家系构建及其表型分析

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Gsdf基因启动子驱动硝基还原酶表达的转基因斑马鱼家系构建及其表...

作者：张婷婷厦门大学

学位级别：硕士

随着鱼类转基因育种技术的快速发展,许多研究开始应用转基因技术构建并培育具备优良性状的养殖鱼类。考虑到转基因个体有可能逃逸到自然环境中,造成一系列生态风险。目前转基因养殖鱼类很难得到推广示范。培育不育的转基因品系是解决这... 详细信息

随着鱼类转基因育种技术的快速发展,许多研究开始应用转基因技术构建并培育具备优良性状的养殖鱼类。考虑到转基因个体有可能逃逸到自然环境中,造成一系列生态风险。目前转基因养殖鱼类很难得到推广示范。培育不育的转基因品系是解决这一问题的有效手段。传统的鱼类不育技术,如杂交不育技术和三倍体不育技术等,虽然行之有效,但存在一些弊端。例如无法大规模制种,且无法实现苗种百分百不育。近年来,不少研究开始应用转基因和基因编辑技术培育不育品系。相对传统的鱼类不育技术,转基因技术可方便大规模制种,且理论上后代可以达到百分百不育。因此,该技术在未来将成为培育不育养殖鱼类品系的重要手段。鱼类的性腺由生殖细胞和体细胞构成。目前应用转基因或基因编辑技术培育不育的鱼类家系,大多以生殖细胞为研究对象,如诱导其凋亡或敲除其生长相关的基因。很少有研究以体细胞为研究对象,开展相关研究。性腺体细胞衍生因子(gonadal somatic cell derived factor,gsdf)属于转化生长因子 β(TGF-β)超家族的成员。该基因仅存在于硬骨鱼类,且特异性表达在性腺的体细胞。硝基还原酶B(NitroreductaseB,nfsB)基因编码的硝基还原酶(Nitroreductase,NTR)蛋白与甲硝唑(Metronidazole,Mtz)结合后产生具有细胞毒性的活性物质,可导致细胞凋亡。本研究以模式动物斑马鱼(Danio rerio)为实验对象,利用Tol2转座子技术,构建可在性腺体细胞特异表达硝基还原酶的转基因品系,再通过甲硝唑的活体暴露,以期实现定时定向诱导性腺体细胞消融,并最终培育转基因不育个体。主要研究结果如下。1.克隆获得斑马鱼gsdf基因核心启动子区,全长2045 bp将其定向插入pminiTol2-nfsB-mCherry质粒中,获得 pminiTol2-gsdf-nfsB-mCherry质粒。将 Tol2转座酶mRNA和pminiTol2-gsdf-nfsB-mCherry质粒同时注射至1-2细胞期的野生型F0代受精卵。利用PCR技术,从F0代性成熟群体中筛选转入外源基因片段nfsB-m Cherry的阳性嵌合体,再将其与野生型斑马鱼测交,进一步筛选获得F1代转基因个体Tg(gsdf:nfsB-mCherry)。RT-PCR结果表明F1代个体在6 dpf(day post-fertilization,dpf)时表达nfsB-m Cherry。在性成熟的 F1 代个体中,nfsB-mCherry的mRNA和mCherry荧光信号都仅表达于性腺。F1代转基因斑马鱼可将所插入的外源基因片段nfsB-mCherry稳定遗传到后代。2.选择21 dpf和28dpf的F1代转基因斑马鱼幼鱼,暴露于5mM甲硝唑水体中,分别暴露21和14天,至42 dpf结束暴露实验,再饲养至性成熟(5月龄)。同时设置2类对照组,一类将转基因幼鱼暴露于含0.2%DMSO(甲硝唑溶剂)水体;一类将野生型幼鱼暴露于5 mM甲硝唑水体。统计5月龄性成熟斑马鱼性别比例,结果表明转基因幼鱼经14天和21天甲硝唑暴露后,雄鱼比例分别为100%和76%;对照组转基因幼鱼经DMSO暴露后,雄鱼比例分别为63%和41%;对照组野生型幼鱼经14天和21天甲硝唑暴露后,雄鱼比例分别为90%和88%。我们进一步比较分析了性成熟个体的生殖力。结果表明14天甲硝唑暴露组雄鱼精巢GSI(性体指数,GonadosomaticIndex)、受精率和两类对照组无显著差异,21天甲硝唑暴露组雄鱼精巢GSI、受精率显著低于两类对照组(Pgsdf、piwil、dazl、sycp3l四个基因的表达变化,以及性成熟转基因雌鱼经甲硝唑暴露14天后卵巢内gsdf和cyp19a1

关键词：斑马鱼转基因 gsdf NTR/Mtz 生殖力

金钱鱼DMRT1和gsdf在性别决定与分化中的功能初步研究

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金钱鱼DMRT1和GSDF在性别决定与分化中的功能初步研究

作者： Umar Farouk Mustapha 广东海洋大学

学位级别：硕士

鱼类性别控制研究是现代水产养殖的热点。金钱鱼(Scatophagus argus,Linnaeus,1766)是一种广盐性鱼类,可作观赏鱼和食用鱼,在养殖群体中性比为1:1。金钱鱼雌鱼的生长比雄鱼快,个体大,有更好经济价值。因此,克隆性别决定主效基因(master ... 详细信息

鱼类性别控制研究是现代水产养殖的热点。金钱鱼(Scatophagus argus,Linnaeus,1766)是一种广盐性鱼类,可作观赏鱼和食用鱼,在养殖群体中性比为1:1。金钱鱼雌鱼的生长比雄鱼快,个体大,有更好经济价值。因此,克隆性别决定主效基因(master sex-determination gene,SD)将有助于金钱鱼的性别控制。本研究旨在研究金钱鱼的性别决定和分化机制,并为以后的单性(全雌鱼)金钱鱼培育提供理论基础。下面为本研究的主要发现:1、金钱鱼性别特异性标记的开发和性别决定候选基因的克隆本研究克隆了金钱鱼Dmrt1(Dmrt1和Dmrt1b)和Dmrt3(Dmrt3和Dmrt3△-Y)的两个亚型。本研究开发了两个位于金钱鱼Dmrt3和Dmrt1上的性别连锁分子标记,分别命名为Dmrt3-Marker-F/R和Dmrt1-Marker-F/R。Dmrt3-Marker-F/R扩增的片段包含能导致截短型Dmrt3(Dmrt3△-Y)c DNA提前编码终止的基因组序列。Dmrt3-Marker-F/R扩增片段的151和166 bp单核苷酸多态性(SNP)显示雌性个体均为CC GG纯合型,而雄性个体均为CG GA杂合型。标记Dmrt3-Marker-F/R扩增片段的166bp是Dmrt3基因内含子的起始位置,该处SNP(c.400+1G>A)会导致Dmrt3产生截短突变。截短型Dmrt3与雄性性别连锁,因此命名为Dmrt3△-Y,它的等位基因即正常Dmrt3位于X染色体。克隆了一个正常的Dmrt1和一个截短的Dmrt1b,它们分别编码300和89个氨基酸。多重序列比较分析显示Dmrt1和Dmrt1b都具有其它物种保守的DM结构域。Dmrt1-Marker-F/R引物扩增片段为正常Dmrt1外显子2和3之间的片段,PCR产物大小为3.2 kb,且雄性特异,表明Dmrt1可能位于Y染色体上。Dmrt1b-Marker-F/R引物能够扩增1.5 kb Dmrt1b的基因组序列,雌雄均能扩增,雌雄个体序列相似度高达99%,表明Dmrt1b并非性别特异,它可能位于X染色体。RT-PCR分析发现Dmrt1只在精巢表达,而Dmrt3△-Y只在部分精巢微弱表达,而在卵巢不表达。研究初步表明雄性特异Dmrt1是金钱鱼的性别决定候选基因。Dmrt3-Marker-F/R和Dmrt1-Marker-F/R标记均在来自中国5个群体的246尾金钱鱼(113雄和133雌)中验证。后面,Dmrt1-Marker-F/R标记又在2000多尾金钱鱼中继续验证。2、金钱鱼中gsdf的克隆表达分析及Dmrt对它的转录调控分析克隆了金钱鱼gsdf部分c DNA序列,包含了开放阅读框654 bp,编码217个氨基酸。金钱鱼gsdf的TGF-β含有保守的半胱氨酸残基。组织分布分析表明,金钱鱼gsdf仅在性腺组织中表达,且其在精巢中的表达显著高于卵巢。通过实时定量PCR分析gsdf,Dmrt1和Sf1在性腺不同发育阶段的表达水平。结果表明,gsdf在V期精巢中的表达明显低于III期和IV期,但其V期精巢中表达水平远高于II期、III期和IV期卵巢。在卵巢中,gsdf在II期表达最高。Dmrt1在精巢(III期、IV期和V期)的表达显著高于各期卵巢(II期、III期和IV期)。在雌鱼中,Sf1在III期的卵巢中高表达,而在精巢不同时期(在III期、IV期和V期)的表达无差异。在这项研究中,制备了山羊抗金钱鱼gsdf抗体,免疫蛋白印迹(WB)结果表明,gsdf在精巢中的表达比卵巢高。免疫组织化学(IHC)研究显示,gsdf仅在II,III,IV和V期精巢的支持细胞中表达。在雌鱼中,gsdf仅在I期,II期和III期卵巢的体细胞中表达,而在IV期卵巢几乎检测不到,表明卵巢后期gsdf的蛋白质表达水平较低。金钱鱼gsdf启动子的序列分析发现在-2647,-2333,-1789,-1555,-751,-201bp处共有六个Sf1结合位点,在-413 bp处有一个Dmrt1结合位点。此外,使用HEK293细胞进行启动子分析显示Sf1单独能以剂量依赖方式激活gsdf转录,而Dmrt1单独不能激活gsdf基因转录。当Dmrt1与Sf1共转染时,Dmrt1能够以剂量依赖性方式激活gsdf表达。Dmrt1或Sf1结合位点的突变,都会导致gsdf启动子活性显著降低。这些结果充分证明Dmrt1或Sf1推断的结合位点是激活金钱鱼gsdf转录调控所必需的。结论:综上所述,在本研究中开发了两个性别特异的标记,表明金钱鱼是XX-XY性别决定系统。Dmrt3-Marker-F/R和Dmrt1-Marker-F/R分别位于Dmrt3和Dmrt1基因座内。Dmrt1b和Dmrt3位于X染色体上,而Dmrt1和Dmrt3Δ-Y位于Y染色体上。XX雌性金钱鱼缺乏具有正常功能的Dmrt1,因此它的

关键词： Dmrt1 gsdf 性别决定与分化性别特异分子标记启动子分析性别决定基因金钱鱼

低温胁迫下斑马鱼bmp10，dusp1分子调控机制的研究及gsdf转基因品系的构建

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低温胁迫下斑马鱼bmp10，dusp1分子调控机制的研究及gsdf转基因品...

作者：郭安宁上海海洋大学

学位级别：硕士

鱼类作为变温动物,温度是鱼类生存过程中最重要的环境因素之一,它不仅决定了鱼类的分布,且直接和间接的影响着鱼类的生理功能和行为。在细胞和分子水平,低温不仅会大大降低酶促反应和体内转运速率,还会诱导蛋白质变性、抑制转录和翻译... 详细信息

鱼类作为变温动物,温度是鱼类生存过程中最重要的环境因素之一,它不仅决定了鱼类的分布,且直接和间接的影响着鱼类的生理功能和行为。在细胞和分子水平,低温不仅会大大降低酶促反应和体内转运速率,还会诱导蛋白质变性、抑制转录和翻译、破坏细胞骨架结构和改变细胞膜通透性等,此外,冷应激还会改变细胞脂双层的特性,包括相变和脂肪酸组成。鱼类的鳃组织直接暴露于外环境中是鱼类感知外部环境压力的第一个器官。鳃对鱼类适应外部环境温度的变化和调节体内生理反应起到至关重要的作用。本实验前期运用CRISPR/CAS9技术分别敲除斑马鱼的bmp10(bone morphogenetic protein 10,bmp10)和dusp1(dual-specificity phosphatase 1,dusp1)基因,发现bmp10和dusp1在低温环境下对斑马鱼的鳃组织凋亡有明显的调控作用,但引起凋亡的分子机制仍不清楚。Bmp10属于TGF-β超家族成员,已有研究证明bmp10在小鼠心脏发育过程中具有重要作用,但在斑马鱼的研究中还缺乏相关报道。本实验室前期运用CRISPR/CAS9技术敲除斑马鱼bmp10基因,成功获得能稳定遗传的F2代,研究发现低温环境下bmp10在鱼类鳃组织细胞凋亡过程中起着重要的调控作用。但其具体的分子调控机制还不清楚。因此,本研究以前期获得的bmp10纯合突变体斑马鱼为研究对象,发现与野生型斑马鱼相比,bmp10纯合突变体斑马鱼在低温环境下P53蛋白表达水平明显增加。同时bmp10纯合突变体斑马鱼在低温环境下P53及其靶基因的mRNA表达水平会迅速升高,鳃组织发生凋亡产生严重损伤,加快bmp10纯合突变体斑马鱼的死亡。双特异性磷酸酶-1(DUSP1/MKP1)作为苏氨酸-酪氨酸双特异性磷酸酶家族的成员,最初在培养的鼠科细胞中被发现。先前的研究表明,dusp1是通过介导细胞外信号调节蛋白激酶的去磷酸化作用行使功能。且在细胞的增殖,分化和凋亡过程中具有重要的调控作用,本实验室前期的研究发现dusp1纯合突变体斑马鱼在低温环境下鳃组织细胞的凋亡明显增加,但引起鳃组织发生凋亡的相关分子调控机制尚不清楚,本研究通过对前期获得的dusp1纯合突变体斑马鱼蛋白水平的检测发现,dusp1纯合突变体斑马鱼在低温环境会导致鳃组织细胞凋亡显著增加,主要是由于MAPK通路中的P38和ERK的磷酸化水平增加,从而加快了鳃组织细胞凋亡,导致鳃组织产生损伤。gsdf是TGF-β超家族的一个特异成员,主要在硬骨鱼类雄性性腺中表达,但在精巢发育过程中的具体分子调控机制尚未清楚。因此,本研究以斑马鱼为研究对象,构建了以小鼠gamma-crystalin启动子启动的Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)荧光素酶报告质粒,采用显微注射技术注射Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)质粒至1细胞期的斑马鱼受精胚胎中。在倒置荧光显微镜下观察和筛选,最终获得19条能够在斑马鱼眼部晶状体特异性表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的嵌合体F0代,然后将表达了绿色荧光蛋白的斑马鱼同野生型(WT)非转基因斑马鱼杂交,最终获得能稳定遗传和表达绿色荧光蛋白的F2代。综上所述,本研究主要揭示了斑马鱼bmp10和dusp1在低温应激过程中鳃组织细胞凋亡调控的相关分子机制,为研究低温对鱼类生长发育的影响提供了重要的理论依据。同时,成功建立了Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)斑马鱼转基因品系,为观察和研究gsdf在精巢发育过程和分子调控机制方面的作用提供了新的方法。总之,研究在低温环境中的相关基因对斑马鱼正常生长发育的影响和性别关键基因在斑马鱼雌雄分化过程中的功能作用,对了解鱼类适应寒冷进化和鱼类性别分化等都有重要的科学意义,同时也为培育抗寒抗冻新种和全雄经济鱼类奠定了重要的生物学基础。

关键词：斑马鱼低温胁迫 bmp10 dusp1 gsdf 精巢发育

黄鳝性逆转过程中gsdf基因cDNA片段的克隆和表达分析

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生命科学研究 2017年第2期21卷 149-153页

作者：潘丽莎荣萍吴昊伟王倩曲宪成上海海洋大学水产与生命学院中国上海201306

通过RT-PCR法从黄鳝性腺中首次克隆获得黄鳝gsdf(gonadal soma-derived factor)基因的片段序列,该片段序列长218 bp,编码72个氨基酸。氨基酸序列分析表明黄鳝gsdf基因片段与其他物种的相似性在61%~76%之间,其中与舌齿鲈(Dicentrarchus l... 详细信息

通过RT-PCR法从黄鳝性腺中首次克隆获得黄鳝gsdf(gonadal soma-derived factor)基因的片段序列,该片段序列长218 bp,编码72个氨基酸。氨基酸序列分析表明黄鳝gsdf基因片段与其他物种的相似性在61%~76%之间,其中与舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)gsdfⅠ型、舌齿鲈gsdfⅡ型同源性最高,均为76%;系统进化树显示,黄鳝gsdf与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)gsdf基因聚成一支,与鲈形目鱼类亲缘关系较近。此外,不同性腺组织的基因检测结果显示,黄鳝gsdf在卵巢和间期性腺的表达量很低,两者没有显著性差异(P>0.05);在精巢组织中的表达量显著高于卵巢、间期性腺组织的表达量(Pgsdf基因可能在黄鳝的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。

关键词：黄鳝性逆转 gsdf 基因克隆与表达实时荧光定量PCR