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启动子对蓝藻中外源egfp基因表达的影响

启动子对蓝藻中外源egfp基因表达的影响

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作者：郭正红上海师范大学

学位级别：硕士

蓝藻是一类能进行光合放氧的原核生物,具有结构简单、适应性强、分布广泛、便于外源基因转化和营养丰富等特点。随着基因工程的发展和蓝藻分子生物学研究的深入,人们通过重组DNA分子技术在蓝藻中构建了一系列新的表达载体,并成功表达了... 详细信息

蓝藻是一类能进行光合放氧的原核生物,具有结构简单、适应性强、分布广泛、便于外源基因转化和营养丰富等特点。随着基因工程的发展和蓝藻分子生物学研究的深入,人们通过重组DNA分子技术在蓝藻中构建了一系列新的表达载体,并成功表达了蓝藻基因工程下游产物。相对于其它基因工程受体系统,蓝藻细胞不仅无毒且有些种类还具有很高的营养价值,使得蓝藻成为一种独特的基因工程受体系统。自1984年适用于接合转移的可在大肠杆菌-蓝藻间穿梭表达的pRL载体构建完成至今,杀蚊幼虫毒素蛋白、人体超氧化歧化酶等一大批外源基因已在蓝藻中成功表达。然而,利用蓝藻基因工程制备重组药物的产业化进程并不顺利,究其原因,外源重组蛋白表达效率低下可能是关键因素之一。集胞藻6803(Synechocystis sp. PCC 6803)为单细胞原核藻类,培养条件简单,可光合自养,在特殊培养条件下也能进行异养生长,其基因组结构简单,序列也已于1996年测定完成,是蓝藻分子生物学研究的模式生物之一,具有天然的外源DNA转化系统;其细胞体积较大,对外源蛋白的容受力较高;有些藻类含有丰富的营养成分,为将来基因工程产物的直接食用提供了可能。本研究首先利用本实验室已经构建好的转基因藻株Pg和Pg-s,运用蛋白免疫印迹检测转基因藻中外源基因的表达水平。明确异源groesl启动子的最佳诱导条件。实验结果表明:当藻细胞生长在衰退期时,经过42℃诱导0.5h,外源eGFP的表达量达到最高;通过转基因Pg和Pg-s藻株中外源基因表达水平的比较,发现SD序列能显著提高外源基因的表达量。其次,本研究依据基因芯片数据,以高光诱导条件下转录水平上调的ndhK基因为目的基因,对其启动子序列进行预测。并把该启动子序列插入到同源重组载体P0上,转化集胞藻6803,得到含ndhK基因启动子片段的转基因藻株P330藻株。通过蛋白免疫印迹,研究不同生长时期、不同高光诱导时间以及二氧化碳浓度下转基因株系中外源基因的表达情况。结果表明,该未知启动子在高光诱导4小时,低二氧化碳培养条件下,使外源egfp基因的表达水平达到最高。比较Pg-s和P330两种不同诱导因子对eGFP的表达水平,经过Western Blot分析表明,P330启动子修饰后的外源基因表达量比Pgroesl加SD序列修饰的外源基因表达量的作用更加明显。本研究分析了集胞藻6803中groesl启动子和SD序列以及新的调控元件P330启动子对外源基因表达作用的特性。结果表明,经过这些调控元件都很大程度的提高了外源基因的表达。这为以后利用蓝藻制备药用基因带来了很大的市场应用的理论基础。

关键词：集胞藻6803 转基因藻株 groesl启动子 P330启动子自然转化

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egfp在集胞藻6803中克隆及其表达调控研究

egfp在集胞藻6803中克隆及其表达调控研究

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作者：康升云上海师范大学

学位级别：硕士

自1968年蓝藻被证实具有遗传重组现象开始,越来越多的人致力于蓝藻基因工程研究。随着蓝藻基因工程的发展,有一批外源基因被导入到蓝藻中表达。主要涉及环境治理、代谢调控、营养保健品和基因工程药物表达等应用领域。但是,外源基因表... 详细信息

自1968年蓝藻被证实具有遗传重组现象开始,越来越多的人致力于蓝藻基因工程研究。随着蓝藻基因工程的发展,有一批外源基因被导入到蓝藻中表达。主要涉及环境治理、代谢调控、营养保健品和基因工程药物表达等应用领域。但是,外源基因表达效率低下的瓶颈制约了蓝藻基因工程的发展,无法实现规模化生产应用。影响基因表达的因素有很多。如:基因拷贝数、密码子偏好性、启动子、终止子、反义RNA技术以及蛋白表达策略等。本研究试图从选择启动子、改变SD序列入手,对改进蓝藻外源基因表达系统和提高外源基因表达效率做一些探讨。集胞藻6803(Synechocystis sp. strain PCC6803)是一种单细胞蓝藻,具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等的特点,在特殊培养条件下还可以进行异养生长,非常适合于利用光合生物反应器大规模生产。因此,集胞藻6803是种很好的蓝藻基因工程受体。本研究选择集胞藻6803染色体DNA中cupA基因及其下游相连的两个片段分别作为上游整合平台(up)和下游整合平台(down),在二者间插入诱导型高效启动子、egfp(增强型绿色荧光蛋白基因)报告基因、卡那霉素抗性筛选标记,构建得到集胞藻6803同源重组双交换整合平台。在整合平台的基础上,通过更换启动子和进行SD序列距离修饰,共得到6个带启动子和1个不带启动子的转化载体。把转化载体分别自然转化到野生型集胞藻6803中,经卡那霉素筛选得到7个转基因藻。它们分别含有能够被红光诱导的Pcpcβ(转pK-Pcpcβ集胞藻6803和转pK-Pcpcβ2集胞藻6803)、被温度诱导的Pgroesl(转pK-Pgroesl集胞藻6803和转pK-Pgroesl2集胞藻6803)、被光照诱导的PpsbA(转pK-PpsbA集胞藻6803和转pK-PpsbA2集胞藻6803)和1个不带启动子的转pK-P0集胞藻6803。根据启动子的不同诱导特性,分别设计梯度诱导条件诱导EGFP表达,通过检测EGFP(增强型绿色荧光蛋白)荧光检测分析。EGFP在488nm光激发下会辐射绿色荧光,利用激光共聚焦显微镜对藻细胞直接进行荧光活性检测。通过比较EGFP的检测结果,判断各转基因藻外源基因表达系统的表达效率。本实验主要结果或结论:1.构建得到6个带启动子的转化载体;2.构建得到1个不带启动子的转化载体;3.通过自然转化获得了7个转基因藻株;4. Pgroesl具有温度诱导增强表达作用;5. SD序列修饰具有上调表达作用。

关键词：蓝藻基因工程同源重组转基因蓝藻表达调控集胞藻6803 绿色荧光蛋白 cpcβ启动子 groesl启动子 psbA启动子 SD序列

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