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Recombination of T4-like Phages and Its Activity against Pathogenic Escherichia coli in Planktonic and Biofilm Forms

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Virologica Sinica 2020年第5期35卷 651-661页

作者： Min Li Donglin Shi Yanxiu Li Yuyi Xiao Mianmian Chen Liang Chen Hong Du Wei Zhang College of Veterinary Medicine Nanjing Agricultural UniversityNanjing 210095China Key Laboratory of Animal Bacteriology Ministry of AgricultureNanjing 210095China MOE Joint International Research Laboratory of Animal Health and Food Safety College of Veterinary MedicineNanjing Agricultural UniversityNanjing 210095China Department of Veterinary Medicine College of Animal Science and TechnologyZhejiang A&F UniversityLin’anHangzhou 311300China Hackensack-Meridian Health Center for Discovery and Innovation NutleyNJ 07110USA Department of Clinical Laboratory The Second Affiliated Hospital of Soochow UniversitySuzhou 215004China

The increasing emergence of multi-drug resistant Escherichia coli(***)has become a global concern,primarily due to the limitation of antimicrobial treatment *** therapy has been considered as a promising alternative for treating infections caused by multi-drug resistant ***,the application of phages as a promising antimicrobial agent is limited by their narrow host range and *** this research,a recombinant T4-like phage,named WGqlae,has been obtained by changing the receptor specificity determinant region of gene 37,using a homologous recombination platform of T4-like phages established by our laboratory *** engineered phage WGqlae can lyse four additional hosts,comparing to its parental phages WG01 and *** showed similar characteristics,including thermo and pH stability,optimal multiplicity of infection and one-step growth curve,to the donor phage *** addition,sequencing results showed that gene 37 of recombinant phage WGqlae had genetically stable even after 20 *** planktonic test,phage WGqlae had significant antimicrobial effects on *** DE192 and DE205 *** optical density at 600 nm(OD600)of *** in phage WGqlae treating group was significantly lower than that of the control group(P\0.01).Besides,phage WGqlae demonstrated an obvious inhibitory effect on the biofilm formation and the clearance of mature *** study suggested that engineered phages may be promising candidates for future phage therapy applications against pathogenic *** in planktonic and biofilm forms.

关键词： T4-like phages Escherichia coli(E.coli) Homologous recombination gp37 Planktonic Biofilm

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Different quasispecies with great mutations hide in the same subgroup J field strain of avian leukosis virus

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Science China(Life Sciences) 2013年第6期56卷 414-420页

作者： MAO YaQing LI WeiHua DONG Xuan LIU JinHua ZHAO Peng College of Veterinary Medicine China Agricultural University China Institute of Veterinary Drug Control College of Veterinary Medicine Shandong Agricultural University

Blood samples were collected from a local strain of chickens associated with serious tumor cases in Shandong Province. The samples were inoculated into chicken embryo fibroblast and DF-1 cells for virus isolation and identification, respectively. The inoculated cells were screened for three common chicken tumor viruses. Nine strains of avian leukosis virus subgroup J （ALV-J） were identified, and were designated LY1201-LYI209. The env gene from the LY1201 strain was amplified and cloned. All nine resultant env clones （clones 01-09） were sequenced, and the gp85 and gp37 amino acid regions were subjected to homology analysis. Clones 01 and 03 had 10 amino acid deletions in the gp85 region compared to the other seven clones, suggesting that at least two quasispecies with obvious mutations coexist in the same field strain. Among these nine clones, three had identical gp85 and gp37 sequences, and were recognized as the dominant LY1201 quasispecies. The amino acid sequence homology of gp37 and gp85 among the nine clones was 98.5%-100.0% and 96.6%-100.0% respectively, suggesting that the gp85 region of the env gene can better display the quasispecies diversity of ALV-J than gp37.

关键词： avian leukosis virus subgroup J(ALV-J) gp85 gp37 quasispecies diversity

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ALV-J感染抑制细胞自噬的机制及其自噬靶向核酸疫苗的研制

ALV-J感染抑制细胞自噬的机制及其自噬靶向核酸疫苗的研制

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作者：戴振凯华南农业大学

学位级别：硕士

J亚群禽白血病(Avian leucosis Subgroup J)是由J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus Subgroup J,ALV-J)引起的肿瘤性疾病。ALV-J感染可以导致机体的免疫抑制,严重危害养禽业的发展。迄今,尚仍无有效防治该病的的药物和疫苗。临床... 详细信息

J亚群禽白血病(Avian leucosis Subgroup J)是由J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus Subgroup J,ALV-J)引起的肿瘤性疾病。ALV-J感染可以导致机体的免疫抑制,严重危害养禽业的发展。迄今,尚仍无有效防治该病的的药物和疫苗。临床上仅通过淘汰阳性鸡来控制该病。因此,深入挖掘J亚群禽白血病的致病机制,研制抗J亚群禽白血病的疫苗刻不容缓。1、本研究应用Western Blot和激光共聚焦显微镜实验等方法对ALV-J对DF-1细胞自噬稳态水平做了检测,发现在ALV-J感染早期,DF-1细胞的自噬稳态水平持续下调。2、本研究用Western Blot技术分析ALV-J感染后自噬底物蛋白p62/SQSTM的表达,结果发现,相对于空白对照,ALV-J感染会造成p62/SQSTM蛋白的积累,表明ALV-J感染下调自噬稳态水平可能是由于阻断自噬的起始阶段造成的。3、本研究为了筛选病毒自噬相关蛋白,构建了ALV-J 9个基因的真核表达载体,应用Western Blot和激光共聚焦显微镜实验技术,检测了过表达ALV-J编码蛋白情况下的自噬的稳态水平。结果发现转染pRK5 flag-gp37组LC3的转化受到抑制,荧光的聚点也小于空载体组,表明ALV-J gp37蛋白可以下调自噬稳态水平。4、本研究为了筛选与ALV-J gp37相互作用的宿主蛋白质,在DF-1细胞中过表达了gp37蛋白,利用做Pull down和质谱分析方法,得到了潜在的五5个与gp37相互作用的宿主蛋白:T-complex 1(TCP-1)、Cyclin dependent kinase 1(CDK1)、Annexin A1(ANXA1)、Heat shock protein 60(HSP60)和LLP homolog,long-term(LLP)。5、本研究利用Western Blot和激光共聚焦免疫荧光的方法检测了5个潜在的ALV-J gp37蛋白互作蛋白(TCP-1、CDK1、ANAXA1、HSP60和LLP)对自噬稳态的影响。结果发现TCP-1显著下调了细胞的自噬稳态水平,表明TCP-1可以抑制细胞自噬;同时利用免疫沉淀技术验证ALV-J gp37和TCP-1互作关系,结果发现gp37与TCP-1在DF-1细胞中发生相互作用。6、本研究研制出自噬靶向核酸疫苗pVAXI-gp85-LC3B,结果发现该核酸疫苗可以诱导鸡产生抗体,并上调外周血中CD3CD8阳性T细胞的数量,诱导IL-2、IL-10和IFN-γ的表达,表明该核酸疫苗具有显著的效果。本研究深入探索了ALV-J抑制细胞自噬的分子机制,研制了抗ALV-J的自噬靶向核酸疫苗,研究结论对了解ALV-J的致病机制,控制ALV的爆发具有重要意义。

关键词： ALV-J 自噬 gp37 TCP-1 核酸疫苗

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钦州地区禽白血病的流行调查及其分离株env基因的分析

钦州地区禽白血病的流行调查及其分离株env基因的分析

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作者：钟兴福广西大学

学位级别：硕士

禽白血病(Avian leukosis, AL)是由统称为禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)的一群病毒引起的多种肿瘤病的总称。ALV给养禽业造成巨大的经济损失,国内外都给予很大关注,目前在全国范围内已经开展流行病学调查和净化工作。广西自... 详细信息

禽白血病(Avian leukosis, AL)是由统称为禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)的一群病毒引起的多种肿瘤病的总称。ALV给养禽业造成巨大的经济损失,国内外都给予很大关注,目前在全国范围内已经开展流行病学调查和净化工作。广西自开展AL的研究和净化工作以来,对玉林、桂林、百色、南宁等主要养禽地区的流调工作已基本完成。本课题选择广西的临海地区——钦州进行相关的流行病学调查以及病毒的分离和基因序列测定与分析,旨在完善全区范围内的主要地方品种鸡及其周围饲养的水禽及其他禽类的流行病学资料,并通过病毒分离和对分离株重要基因进行测序分析与比较,进一步掌握当地禽类感染ALV的亚型及分离株的遗传变异情况,为当地的净化与防控工作提供依据。首先,课题采集钦州地区饲养的铁脚麻鸡、“海鸭蛋”麻鸭、狮头鹅、鸽子和火鸡5个主要家禽品种的肛拭、蛋清和血清共计953份样品,应用IDEXX生产的商品化ALV-p27抗原和A/B、J抗体ELISA检测试剂盒进行检测。结果显示,除了铁脚麻鸡的肛拭样品之p27抗原阳性率为13.04%(12/92)、蛋清样品之p27抗原阳性率为3.26%(3/92)及血清样品之A/B抗体阳性率为5.08%(3/59)之外,其它样品及项目的检测的阳性率均为0%。其次,课题对抗原或抗体检测为阳性的16份样品、铁脚麻鸡检测阴性的16份样品以及火鸡检测阴性的33份样品共65份样品相对应的禽只的血清进行DF-1细胞培养的病毒分离,再用ELISA和PCR的方法分别检测其F2代的细胞培养液和培养物,经鉴定为阳性的样品再进行病毒e7nv基因的扩增及其序列的测定与分析。结果从65份样品中分离出2株J亚群ALV(分别命名为QZ2和QZ14),QZ2和QZ14的env基因核苷酸同源性很高(95.7%);它们gp37基因核苷酸及其编码的氨基酸与J亚群参考株的同源性都在90%以上,env与gp85基因核苷酸与J亚群参考株(除ADOL-7501外)的同源性也都在90%以上,而gp85基因编码的氨基酸与J亚群参考株的同源性在70.5%～90.9%之间,与原型株HPRS103的达90%以上,U3区基因核苷酸与J亚群参考株的同源性在87.6%～92.9%之间,QZ2的E元件基本保持完整,而QZ14有5个碱基的缺失。本课题研究的结果表明,钦州地区5个主要禽类中仅铁脚麻鸡存在ALV的感染,经分离鉴定为J亚群,基因序列分析表明QZ2和QZ14的不同基因已发生变异。

关键词：钦州禽白血病流行调查病毒分离 AVL-J evv基因 gp85 gp37

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