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苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）Rm1021中gntr家族转录因子功能的初步研究

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苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）Rm1021中GntR家族转录...

作者：王毅福建农林大学

学位级别：硕士

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)Rm1021是研究根瘤菌和豆科植物共生作用的模式菌株，于2001年完成基因组测序，gntr家族转录因子是Rm1021菌株中是第二大类转录因子。gntr家族转录因子在原核生物中普遍存在，调控各类重要代谢途... 详细信息

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)Rm1021是研究根瘤菌和豆科植物共生作用的模式菌株，于2001年完成基因组测序，gntr家族转录因子是Rm1021菌株中是第二大类转录因子。gntr家族转录因子在原核生物中普遍存在，调控各类重要代谢途径，对细胞的生长和发育起着不可替代的作用。有一些gntr家族转录因子在其它细菌中的已经研究的相当清楚，但在根瘤菌中的研究却很少。为了弄清根瘤菌gntr家族转录因子在的调控机制，我们对苜蓿中华根瘤菌(***)Rm1021基因组序列进行了全面的分析。搜索到55个编码gntr家族转录因子的候选基因，根据序列同源性将其分成4类，3类可以归属到已有的分类中，另外还有单独列为一类。利用自杀性质粒，对这些候选基因进行了逐一定向突变，获得了55个gntr基因突变株。对所有突变体从共生和自生表型的进行筛选。共生方面的筛选结果表明，所有的突变体都能诱导紫花苜蓿根部形成有效瘤，接种植株在无氮条件能够正常生长。关于这些突变体与野生型Rm1021在结瘤竞争性和结瘤动力学方面是否存在差异则需要进一步的研究。自生方面的筛选结果表明，所有突变体产生的多糖与野生型没有明显差异。在泳动能力方面，筛选到两个在半固体LB／MC培养基上运动变慢的突变株，gtrA1和gtrB1突变株。gtrA1和gtrB1突变株的生长变慢，停滞期的细胞最大产量低于野生型。进一步的研究还发现gtrA1和gtrB1突变株虽然可以侵染宿主植物，形成正常根瘤，但是固氮能力有所下降，尤其是竞争性结瘤能力显著下降。至于它们的调节机制，还有待进一步的研究。

关键词：苜蓿中华根瘤菌 gntr gtrA1 gtrB1

葡萄糖酸盐介导副溶血弧菌gntr蛋白调控宿主肠道定殖的研究

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葡萄糖酸盐介导副溶血弧菌GntR蛋白调控宿主肠道定殖的研究

作者：李阳扬州大学

学位级别：硕士

副溶血弧菌是一种重要的食源性病原菌,是一种革兰氏阴性菌,感染后主要定殖在宿主的肠道。食用生的或者未煮熟携带副溶血弧菌的海鲜产品可导致急性肠胃炎,常见的感染副溶血弧菌的临床表现有腹痛、腹泻、恶心、呕吐并伴有发热等症状。副... 详细信息

副溶血弧菌是一种重要的食源性病原菌,是一种革兰氏阴性菌,感染后主要定殖在宿主的肠道。食用生的或者未煮熟携带副溶血弧菌的海鲜产品可导致急性肠胃炎,常见的感染副溶血弧菌的临床表现有腹痛、腹泻、恶心、呕吐并伴有发热等症状。副溶血弧菌除了给人类健康带来巨大危害,还给海产品养殖业带来巨大经济损失。耐热直接溶血素(TDH)、耐热相关溶血素(TRH)、Ⅲ型分泌系统(T3SS)、Ⅵ型分泌系统(T6SS)和黏附素等是副溶血弧菌常见的毒力因子,此外运动性也和副溶血弧菌的毒力相关。其中Ⅲ型分泌系统(T3SS)与副溶血弧菌的肠毒性有关,其分泌的效应蛋白在副溶血弧菌的致病性发挥重要作用。幼兔模型常被用来研究副溶血弧菌肠道致病性,通过对其减毒机制进行研究,有望为副溶血弧菌感染的防控提供新视野、新思路。前期研究通过Tn-seq在幼兔模型体内试验成功筛选出副溶血弧菌230个减毒基因,其中包括VP0058(gntr)。本研究通过同源重组的方法构建Δgntr缺失株、质粒回补株,用幼兔模型模拟肠道感染进行验证,通过一系列的体外实验对Δgntr缺失株的生物学特性进行评价,进一步通过RNA-seq的方法筛选gntr蛋白的下游调控基因并进行鉴定。1.副溶血弧菌Δgntr突变株的构建及其生物学特性鉴定利用同源重组的原理成功构建出Δgntr基因缺失突变株,野生株和突变株同时感染三日龄的幼兔,缺失株感染的幼兔腹泻和肠道病变显著减弱,并且肠道定殖能力也显著减弱,进一步证明Δgntr缺失株具有明显的减毒效果。基于此,进一步测定了副溶血弧菌野生株和Δgntr缺失株的生长曲线、运动性和酸应激试验。生长曲线结果表明野生株和Δgntr缺失株的生长无明显差异,运动性的检测结果也无显著差异,说明gntr并非通过运动性调控副溶血弧菌宿主肠道定殖。酸应激的结果表明无论是在pH 6.5还是pH 5.5的应激条件下,与野生株相比Δgntr缺失株对酸的耐受能力表现出明显的下降,而回补株又恢复到与野生株相当的水平。因此,我们认为Δgntr缺失株在酸性环境中存活能力显著减弱,推测这是Agntr缺失株在幼兔肠道中定殖量减少的原因之一。***基因调控副溶血弧菌葡萄糖酸盐利用系统介导其肠道定殖gntr蛋白是一个转录调控因子,通过转录组测序的方法筛选gntr蛋白的下游调控基因。结果表明副溶血弧菌中357个基因的表达受gntr调控,其中61个基因表达上调,296个基因表达下调。KEGG信号通路分析显示葡萄糖酸盐利用系统基因的表达受gntr蛋白的调控,blast 比对发现该基因簇与霍乱弧菌的葡萄糖酸盐利用基因(edd、gntK、gntT和eda)具有较高的同源性。qRT-PCR进一步验证了在Δgntr缺失株中edd、gntK、gntT和eda的转录水平显著上调,而回补株又恢复到与野生株相当的水平。生物信息分析发现edd-gntK-gntT-eda基因簇含一个双向的启动子区域,EMSA结果发现gntr蛋白可以直接结合到该启动子区域抑制葡萄糖酸盐系统基因的表达,而葡萄糖酸盐可以竞争性的抑制这一结合作用,诱导葡萄糖酸盐利用系统基因的表达。此外我们发现Δgntr和Δgnt(ΔeddΔgntKΔgntTΔeda)在以葡萄糖酸盐为唯一碳源的M9培养基中不能存活,有意思的是当同时添加了葡萄糖和葡萄糖酸盐时Δgntr缺失株依然不能生长。进一步研究发现在低浓度(10uM)的葡萄糖酸盐条件下,Δgntr缺失株依然不能生长,而当浓度上升到50 uM后,又可以继续生长。在低浓度(10 uM)葡萄糖酸盐情况下gntr基因缺失导致下游葡萄糖酸盐利用基因的过表达,葡萄糖酸盐代谢的中间代谢产物过量积累抑制细菌的生长,导致其肠道定殖量减少;而在高浓度(50 uM)葡萄糖酸盐条件下,出现反馈抑制,葡萄糖酸盐利用基因表达水平减弱,突变株又恢复生长。在副溶血弧菌的防治过程中,由于抗生素滥用导致细菌耐药性加重,本研究中关于gntr的调控机理和葡萄糖酸酸盐在其中扮演的角色,为副溶血弧菌的防控提供了新思路和方向。

关键词：副溶血弧菌定殖葡萄糖酸盐转录调控因子 gntr

布鲁氏菌gntr缺失菌株构建及其对山羊肺泡巨噬细胞内质网应激的影响

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布鲁氏菌GntR缺失菌株构建及其对山羊肺泡巨噬细胞内质网应激的影...

作者：支飞杰西北农林科技大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌(Brucella)是革兰阴性细菌,多呈小球杆状或短杆状。布鲁氏菌能够感染人和多种动物,其中包括羊、牛和猪等家畜,引起重要的人兽共患传染病—布鲁氏菌病(Brucellosis)。布鲁氏菌病不仅对畜牧业造成巨大损失,而且还严重危害人类健... 详细信息

布鲁氏菌(Brucella)是革兰阴性细菌,多呈小球杆状或短杆状。布鲁氏菌能够感染人和多种动物,其中包括羊、牛和猪等家畜,引起重要的人兽共患传染病—布鲁氏菌病(Brucellosis)。布鲁氏菌病不仅对畜牧业造成巨大损失,而且还严重危害人类健康。布鲁氏菌作为兼性胞内寄生菌主要感染吞噬细胞和胚胎滋养层细胞,并且能够逃脱溶酶体杀伤从而完成胞内循环,造成机体的长期感染。山羊肺泡巨噬细胞作为布鲁氏菌感染的主要靶细胞,具有吞噬、免疫和分泌细胞因子的作用。本研究构建布鲁氏菌S2菌株(***.S2)gntr样转录调控因子BSS2I0438(gntr)原核表达载体,制备gntr多克隆抗体。通过同源重组方法构建***.S2的gntr基因缺失菌株(Δgntr),研究gntr基因的缺失对Ⅳ型分泌系统(the typeⅣsecretion system,T4SS)的影响和Δgntr菌株在山羊肺泡巨噬细胞内增殖情况,通过检测内质网应激(ER stress,ERS)相关蛋白的表达变化,分析Δgntr菌株与内质网相互作用中的关系;同时,检测山羊肺泡巨噬细胞培养液中TNF-α,IFN-γ,IL-1β和IL-10的变化,探究Δgntr菌株感染山羊肺泡巨噬细胞期间细胞免疫活性的变化。试验结果如下:1.克隆***.S2菌株的gntr基因,构建PET32a-gntr原核表达载体,表达并纯化gntr融合蛋白。免疫小鼠,经三次基础免疫和一次加强免疫之后,ELISA检测抗体效价,达标后小鼠眼眶采血并分离血清,即获得gntr多克隆抗体。2.构建重组载体PUC19-gntr,经酶切和测序鉴定正确后,通过电转化将重组载体PUC19-gntr转入***.S2感受态细胞中,经50μg/m L庆大霉素抗性TSA固体平板培养基筛选、PCR筛选和Western blotting验证,获得Δgntr菌株。利用qRT-PCR的方法,检测Δgntr菌株的T4SS结构基因的表达,表明VirB1、VirB9和VirB11无显著差异,而VirB2、Vir B6和VirB8显著下调,结果表明gntr基因的缺失可以影响T4SS结构基因的表达。3.检测Δgntr菌株在山羊肺泡巨噬细胞内增殖,试验表明gntr基因的缺失不影响布鲁氏菌在胞内的增殖。通过qRT-PCR检测GRP78和CHOP的表达以及Western-blotting检测GRP78的表达,表明Δgntr菌株在感染山羊肺泡巨噬细胞前期GRP78表达量增加,而在后期GRP78表达量减少;CHOP在感染前期表达量无显著差异,但后期表达量显著升高。结果表明gntr参与了布鲁氏菌与内质网的相互作用。改变ERS状态检测Δgntr菌株在胞内增殖的数量,试验表明抑制ERSΔgntr菌株胞内增殖数量增加。此外,通过ELISA分别检测TNF-α,IFN-γ,IL-1β和IL-10的变化,表明TNF-α的表达量在感染12 h和24 h时显著增加(Pgntr菌株在感染前期能够促进早期TNF-α的分泌。

关键词：布鲁氏菌S2株 gntr 内质网应激细胞因子

布鲁氏菌VirB及gntr在胞内生存中的研究

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布鲁氏菌VirB及GntR在胞内生存中的研究

作者：高光俊西南大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病是由布氏杆菌(Brucella)这种胞内寄生菌引起的一种全球性的人畜共患的传染性疾病,给全世界人类健康和农牧业生产带来了巨大的。编码布鲁氏菌毒力因子VirB与调控因子gntr的基因是布鲁氏菌中最为重要的基因之一在抵御宿主的免... 详细信息

布鲁氏菌病是由布氏杆菌(Brucella)这种胞内寄生菌引起的一种全球性的人畜共患的传染性疾病,给全世界人类健康和农牧业生产带来了巨大的。编码布鲁氏菌毒力因子VirB与调控因子gntr的基因是布鲁氏菌中最为重要的基因之一在抵御宿主的免疫杀伤作用,并最终建立和维持胞内生存过程中发挥了重要的作用。但其具体的致病机制或调控机理方面还存在着众多的疑问。为此,深入研究和认识VirB与gntr在布鲁氏菌胞内感染以及相关的代谢通路,对正确揭示布鲁氏菌的胞内生存机制、致病机理方面具有十分重要的作用,为新疫苗和治疗药物研究方面提供了坚实的理论依据,在布鲁氏菌防控工作方面也将起到十分重要的指导意义。在相关研究的基础上,本文主要采用抗性替换的原理来构建VirB与gntr缺失株。本研究以验证后的缺失株16M△virB.16M△gntr为研究材料,对布鲁氏菌毒力表型、布鲁氏菌胞内环境适应性方面对其进行了相关的分析,并在相关毒力研究与分析的基础上,对其所相关的调控网络和代谢通路,进行了深入的研究。本研究成功地构建了布鲁氏菌VirB与gntr的缺失株.virB与gntr基因缺失,virB缺失导致菌株生长速度减慢,极大地影响了布鲁氏菌的生存。体外模拟巨噬细胞的胞内环境适应性分析表明;体外胁迫胁下的应激实验发现***突变株在多种胁迫环境中的生存能力均降低,表明VirB,gntr有利于布鲁氏菌抵抗各种恶劣环境。布鲁氏菌多种重要基因的转录学分析布鲁氏菌***在布鲁氏菌毒力、体外应激以及相关调控方面具有十分重要的作用。重要调控因子gntr在布鲁氏菌生物素合成过程中发挥了十分重要的作用,是布鲁氏菌生物素合成过程中的主要调控因子。以上布鲁氏菌毒力、体外适应性分析、转录学等多种实验结果表明：VirB. gntr在布鲁氏菌胞内生存、毒力的发挥以及代谢通路网络方面居于十分关键的的位置,在布鲁氏菌的致病机理和感染建立方面发挥了十分重要的作用。本课题就VirB及gntr两种重要的毒力(调控)因子布鲁氏菌在宿主机体和胞内生存中的的有关作用机理进行了深入的研究,对其进行了一个全新的认识,布鲁氏菌胞内生存机制的理解以及布鲁氏菌胞内生存相关的分子机制的理解,为以后布鲁氏菌慢性感染的建立等复杂机理提供了重要线索,为布鲁氏菌疫苗或药物靶点的开发提供了新的线索,同时也为布鲁氏菌有效的防控提供了坚实的基础。

关键词：布鲁氏菌 VirB gntr 代谢通路致病机理

副溶血弧菌响应葡萄糖酸盐相关基因筛选与研究

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副溶血弧菌响应葡萄糖酸盐相关基因筛选与研究

作者：张友昆扬州大学

学位级别：硕士

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是我国乃至全球水产养殖业中重要的食源性病原菌,广泛分布于海洋环境中,生食携带副溶血弧菌的海产品可以引起腹痛、腹泻、呕吐和发热等症状,严重者甚至导致死亡。葡萄糖酸盐作为常用的食品添加剂可... 详细信息

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是我国乃至全球水产养殖业中重要的食源性病原菌,广泛分布于海洋环境中,生食携带副溶血弧菌的海产品可以引起腹痛、腹泻、呕吐和发热等症状,严重者甚至导致死亡。葡萄糖酸盐作为常用的食品添加剂可用于提高食品口感,营养价值及保质期。在养殖业中,葡萄糖酸盐作为饲料添加剂可以促进肠道益生菌的生长,提高养殖物种的生长性能和肠道健康。研究表明,副溶血弧菌能够以葡萄糖酸盐为唯一碳源,维持其在营养匮乏条件中生存,但葡萄糖酸盐这一饲料添加剂对肠道病原微生物的影响目前尚不清楚。为了探究葡萄糖酸盐对副溶血弧菌基因表达谱的影响,通过RNA-seq分析了副溶血弧菌在葡萄糖酸盐条件下的基因表达差异。结果表明,共有623个基因表达具有显著差异,其中287个基因显著上调,336个基因显著下调。值得注意的是,这些上调的基因包括糖酵解途径、三羧酸循环以及戊糖磷酸途径等信号通路相关基因;而下调的基因主要涉及Ⅲ型分泌系统1(T3SS1)和Ⅵ型分泌系统(T6SS1)等毒力相关通路基因,并进一步通过qRT-PCR的方法验证了上述结果。此外,RNA-seq和qRT-PCR的结果表明葡萄糖酸盐能够显著诱导葡萄糖酸盐利用系统的基因(gntr-edd-gntK-gntT-eda)的上调表达。因此,本研究利用同源重组的原理构建了Δgntr和整个葡萄糖酸盐利用基因簇的缺失突变株Δgnt,并对其在不同葡萄糖酸盐条件下的生长曲线和生物被膜形成能力进行了测定。结果显示Δgntr和Δgnt在以葡萄糖酸盐为唯一碳源条件下无法生长,进一步证实了gntr和edd-gntK-gntT-eda是副溶血弧菌葡萄糖酸盐利用系统。生长曲线结果表明,随着葡糖糖酸盐浓度的增加,WT的生长能力也增强,表明葡萄糖酸盐能够利于副溶血弧菌的生长。而Δgntr在低浓度的葡萄糖酸盐条件下无法生长,却能够在50 mM和100 mM的葡萄糖酸盐条件下正常生长,推测可能是由于在低浓度的葡萄糖酸盐条件下中间代谢产物的大量积累,使得副溶血弧菌无法生长,随着葡萄糖酸盐浓度的增加,大量积累的中间代谢产物形成反馈抑制,使得病原菌又能够正常生长。生物被膜的检测结果表明gntr蛋白能够响应葡萄糖酸盐信号抑制副溶血弧菌生物被膜形成的能力。为了深入探究gntr蛋白响应葡萄糖酸盐调控副溶血弧菌葡萄糖酸盐利用系统表达的分子机制,本研究表达纯化了 gntr蛋白,EMSA结果显示gntr蛋白能够直接结合到gnt双向启动子区域,并发现在gnt启动子上存在两个gntr蛋白的结合位点。基于生物信息学预测了 gntr蛋白结构,发现gntr蛋白具有与糖分子配对的AF-2 口袋,分子对接模拟获得了 gntr蛋白与葡萄糖酸盐结合的模型及其关键氨基酸位点,并构建关键氨基酸点突变株。qRT-PCR结果表明Tyr141、Arg231和Arg235是gntr蛋白与葡萄糖酸盐结合的关键氨基酸位点。最后在细胞和动物模型上考察了葡萄糖酸盐对副溶血弧菌毒力的影响。细胞毒性结果显示,葡萄糖酸盐能够显著增强副溶血弧菌对HeLa细胞的细胞毒性,而Δgntr的细胞毒性显著下调,并且不受葡萄糖酸盐浓度变化的影响,表明gntr蛋白能够响应葡萄糖酸盐信号调控副溶血弧菌的细胞毒性。斑马鱼毒力实验也表明在体内条件下葡萄糖酸盐能够诱导副溶血弧菌的毒力。综上所述,葡萄糖酸盐作为一种饲料添加剂能够增强副溶血弧菌的致病性,具有一定的潜在风险。

关键词：副溶血弧菌 gntr 葡萄糖酸盐斑马鱼饲料添加剂

猪链球菌人源分离株的抗血液杀伤能力与其荚膜合成基因簇变异位点的相关性研究

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猪链球菌人源分离株的抗血液杀伤能力与其荚膜合成基因簇变异位点...

作者：周颖华中农业大学

学位级别：硕士

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病病原菌,它能够引起猪和人的多种疾病,包括败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎,甚至导致死亡。不仅给世界的养猪业带来了巨大的经济损失,而且对世界公共安全造成了威胁。因为猪链球菌... 详细信息

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病病原菌,它能够引起猪和人的多种疾病,包括败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎,甚至导致死亡。不仅给世界的养猪业带来了巨大的经济损失,而且对世界公共安全造成了威胁。因为猪链球菌不仅可以经由伤口感染人,还能经由胃肠道感染人,所以越来越多的学者认为猪链球菌应该被评估为一种新的食源性病原菌。在猪链球菌感染人的过程中,血液是一道重要的免疫屏障。在已被报道的猪链球菌的众多毒力因子中,荚膜是在猪链球菌感染过程中第一个与血液接触的组分,也是猪链球菌抵抗血液中先天免疫的重要毒力因子。猪链球菌的荚膜由其基因组上一段成簇排列的基因共同调控合成,为了探究猪链球菌抗血液杀伤的能力与荚膜合成基因簇的相关性,本课题以欧洲标准菌株P1/7和2005年四川大爆发菌株SC19为参考菌株,基于全血杀伤实验,从103株猪链球菌人源分离株中筛选出了一株抗血液杀伤能力极强的菌株LSM128,并试图从其荚膜合成基因簇的变异位点中找出导致其抗血液杀伤能力极强的原因。主要结果如下:(1)通过生物信息学分析,我们发现猪链球菌人源分离株LSM128的荚膜合成基因簇相比猪链球菌标准株P1/7并未发生变异。但在其荚膜合成基因簇上游的一个转录调节基因gntr上的第1219个碱基位点发生了错义突变,由鸟嘌呤突变为腺嘌呤,导致丙氨酸(Ala)突变为苏氨酸(Thr)。(2)以猪链球菌P1/7和LSM128作为亲本株,通过同源重组,成功构建了P1/7和LSM128的gntr基因缺失株和置换株。通过表型实验,我们发现gntr并不是调控荚膜表达的主要基因。(3)通过对猪链球菌P1/7和LSM128及其gntr基因缺失株和置换株的毒力评价,我们发现gntr与猪链球菌的毒力相关,但在不同菌株中影响程度不同。在P1/7中,缺失gntr基因能够导致毒力的上调,但在LSM128中缺失gntr基因后,毒力的变化却不显著。值得注意的是,LSM128的gntr基因上的突变能够显著地提高P1/7的抗血液杀伤的能力和毒力。综上,我们认为gntr基因与猪链球菌的抗血液杀伤能力和毒力有关,但不具有普适性,且不是通过调控荚膜的表达来影响猪链球菌的抗血液杀伤能力和毒力。而gntr的第1219个碱基位点是它影响猪链球菌抗血液杀伤能力和毒力的重要位点。

关键词：猪链球菌荚膜合成基因簇 gntr SNP 毒力