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甘蔗鞭黑粉菌两个有性配合缺陷突变体目标基因的分离与鉴定

甘蔗鞭黑粉菌两个有性配合缺陷突变体目标基因的分离与鉴定

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作者：张小萌华南农业大学

学位级别：硕士

由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗鞭黑穗病是一种重要的甘蔗病害,已对我国甘蔗糖业造成严重的影响。开展该病菌有性配合与致病相关基因的分离与功能鉴定,可为从分子水平上了解甘蔗鞭黑粉菌的致病机制及病菌与甘蔗的... 详细信息

由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗鞭黑穗病是一种重要的甘蔗病害,已对我国甘蔗糖业造成严重的影响。开展该病菌有性配合与致病相关基因的分离与功能鉴定,可为从分子水平上了解甘蔗鞭黑粉菌的致病机制及病菌与甘蔗的相互作用提供依据,同时也可为抗病育种提供理论基础和技术支撑。本研究以甘蔗鞭黑粉菌野生型菌株WT18和WT17为出发菌株,用根癌农杆菌介导的转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)方法,建立了拥有13000个具有潮霉素抗性的T-DNA随机插入突变体库;经营养平板上有性配合试验,筛选获得了12个有性配合能力缺陷突变体,PCR验证和Southern杂交分析结果表明T-DNA插入在甘蔗鞭黑粉菌基因组中且均为单拷贝插入。随机挑选3个出自WT18的缺乏有性配合能力突变体33、91和14137及1个出自WT17的有性配合能力明显减弱突变体6425与相对性系野生型菌株菌体等量混合后注射接种甘蔗苗,结果表明野生型发病率为100%、突变体91和突变体6425发病率为26.67%,而突变体33和14137则不能使甘蔗苗发病。利用hiTAIL-PCR技术对其中突变体6425和33的T-DNA插入基因进行扩增并以发表的基因组序列进行比对分析,结果显示突变体6425的T-DNA插入在g5893基因的启动子区域,该基因与维持端粒覆盖的作用相关;突变体33的T-DNA插入在g4800基因的启动子区,该基因可能与甾醇Δ5,6-去饱和酶的作用相关。qRT-PCR检测显示在突变体6425中,g5893基因的表达降低60%;在突变体33中,g4800基因表达降低了50%。运用split marker的方法,根据g5893基因和g4800基因的侧翼序列以及潮霉素序列,分别设计了4对特异性引物,构建了用于同源敲除的融合PCR片段;通过PEg转化和对转化子的筛选验证,成功获得了突变体6425的敲除突变体Δg5893和33的敲除突变体Δg4800。在MM培养平板上敲除突变体Δg5893的配合能力弱于野生型,且对过氧化氢不敏感,对高盐的耐受能力降低。而敲除突变体Δg4800的配合能力和野生型没有差异,表明基因g4800与甘蔗鞭黑粉菌有性配合能力无关,基因g4800也不是原突变体33中T-DNA插入突变所影响的有性配合相关基因。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌有性配合 g5893基因 g4800基因

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