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云南大学学报（自然科学版） 2022年第1期44卷 195-202页

作者：杜玲张加雪袁灵月谌丽妃李迎丽邱景富重庆医科大学公共卫生与管理学院重庆400016

铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)是细菌重要的调控因子,研究旨在探究肺炎克雷伯菌Fur对铁摄入及生物膜形成的影响,分析Fur对可能的靶基因fyua(耶尔森菌素的受体)的调控作用.首先,采用同源重组技术构建突变株Δfur及回补株C... 详细信息

铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)是细菌重要的调控因子,研究旨在探究肺炎克雷伯菌Fur对铁摄入及生物膜形成的影响,分析Fur对可能的靶基因fyua(耶尔森菌素的受体)的调控作用.首先,采用同源重组技术构建突变株Δfur及回补株C-Δfur.然后,采用生长曲线、CAS检测和结晶紫染色对野生株、突变株及回补株的铁摄入及生物膜形成表型进行测定.最后,通过RT-qPCR及GFP报告基因融合实验明确Fur对fyua的调控.结果显示,成功构建突变株及回补株;生长曲线分析表明fur基因影响细菌生长速度;fur的缺失使铁载体的生成量增加,生物膜的形成减少;铁充足条件下,Fur负调控fyua基因的表达.研究通过构建fur基因敲除株,初步分析了肺炎克雷伯菌铁摄取调节蛋白Fur的功能,明确了Fur对fyua的转录调控机制.

关键词：肺炎克雷伯菌转录调控 Fur fyua

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APEC强毒力岛核心基因irp2、fyua敲除对其致病性影响的研究

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中国兽医学报 2014年第4期34卷 564-570页

作者：邵颖涂健汪雪雁周秀红白灏韩先干祁克宗安徽农业大学安徽合肥230036 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

采用Red同源重组技术分别构建出APEC irp2单基因敲除株△AE17和irp2、fyua双基因敲除株△△AE17。运用活菌计数法分别观察AE17、△AE17、△△AE17黏附鸡胚成纤维细胞DF-1的能力。并且应用Real-time PCR检测AE17、△AE17和△△AE17中的lu... 详细信息

采用Red同源重组技术分别构建出APEC irp2单基因敲除株△AE17和irp2、fyua双基因敲除株△△AE17。运用活菌计数法分别观察AE17、△AE17、△△AE17黏附鸡胚成纤维细胞DF-1的能力。并且应用Real-time PCR检测AE17、△AE17和△△AE17中的luxs,pfs,tsh,ibeA,stx2f,iss,ompA,fimC 8个毒力基因转录水平。结果成功构建出基因敲除株△AE17和△△AE17,它们黏附DF-1细胞的能力分别下降为AE17的66.04%和53.54%。同时,Real-time PCR结果显示,△AE17的luxs,iss,ompA和fimC等4个毒力基因的转录水平均极显著下降(Pfyua双基因敲除较irp2单基因敲除对APEC的致病性影响更显著。

关键词： APEC 强毒力岛 irp2 fyua 致病性

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大肠埃希菌强毒力岛核心基因fyua研究进展

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动物医学进展 2016年第8期37卷 79-81页

作者：王庄张泽辉刘耀川张德显刘明春沈阳农业大学畜牧兽医学院辽宁沈阳110866 辽宁省重大动物疫病应急中心辽宁沈阳110161

强毒力岛(HPI)基因最先在耶尔森菌体内检出,是一种负责编码合成、调节和运输铁转运系统相关受体蛋白的基因,可显著提高细菌的毒力。HPI通过水平转移进入大肠埃希菌中,提高大肠埃希菌致病性及生存增殖能力,对食品安全、人类健康造成危害... 详细信息

强毒力岛(HPI)基因最先在耶尔森菌体内检出,是一种负责编码合成、调节和运输铁转运系统相关受体蛋白的基因,可显著提高细菌的毒力。HPI通过水平转移进入大肠埃希菌中,提高大肠埃希菌致病性及生存增殖能力,对食品安全、人类健康造成危害。fyua基因位于HPI的核心功能区irp2-fyua基因簇,常作为HPI毒力岛基因检测的标志性基因之一。关于fyua基因及其表达产物的研究将为大肠埃希菌感染性疾病的治疗与预防提供新思路。

关键词：强毒力岛大肠埃希菌 fyua

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APEC毒力岛基因irp2、fyua缺失对其毒力影响的研究

APEC毒力岛基因irp2、fyua缺失对其毒力影响的研究

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作者：邵颖安徽农业大学

学位级别：硕士

禽致病性大肠杆菌病(Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC)是引起禽类高死亡率的重要传染病之一,给养禽业的发展带来了严重危害。而耶尔森菌强毒力岛(high pathogenicity island, HPI)是决定包括APEC在内的多种肠道致病菌毒力和致... 详细信息

禽致病性大肠杆菌病(Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC)是引起禽类高死亡率的重要传染病之一,给养禽业的发展带来了严重危害。而耶尔森菌强毒力岛(high pathogenicity island, HPI)是决定包括APEC在内的多种肠道致病菌毒力和致病性的一个较大的染色体片段。有研究表明,irp2和.fyua基因与铁的摄取有关,是HPI的核心结构和功能基因,但是有关其与APEC毒力之问的关系并未见详细报道。本研究从HPI的主要结构基因irp2、fyua入手,分别构建了禽致病性大肠杆菌irp2和irp2|fyua基因缺失株,并研究基因缺失对其毒力因子转录水平、黏附DF-1细胞能力、半数致死量以及感染雏鸡病理变化的影响,进而揭示了irp2、 fyua基因与APEC毒力之间的关系,为后续进一步明确HPI对APEC毒力的影响奠定一些基础。具体的研究内容和结果如下：1、禽致病性大肠杆菌irp2和irp2|fyua缺失株的构建本实验利用Red同源重组技术对目的基因irp2、fyua进行了分步缺失。首先将irp2基因的同源臂克隆至零背景克隆载体,然后将pKD3质粒上的氯霉素抗性片段克隆插入到零背景载体中,形成用于Red同源重组的打靶序列。利用Red同源重组原理30℃表达出诱导蛋白,将该打靶序列的PCR产物电转化至目的菌中,从而实现基因的互换。利用氯霉素的抗性标记筛选出重组成功的菌株,并将pCP20质粒电转至阳性菌株用于氯霉素抗性的消除,这样就成功获得irp2单基因缺失株。以irp2单基因缺失株为出发株,利用同上的方法,进行fyua基因的缺失,成功获得irp2|fyua双基因缺失株。2、禽致病性大肠杆菌irp2缺失对其毒力的影响本实验分别从RT-PCR法检测毒力基因的转录水平、生长曲线的测定、对DF-1细胞黏附力的比较、LD50的测定、感染动物病理组织切片的观察等方面探索了HPI毒力岛irp2的缺失对禽致病性大肠杆菌毒力的影响。Real-time PCR结果显示,与野生株相比,irp2缺失株的luxS, iss, ompA和fimC等4个毒力基因的转录水平均极显著下降(Pfyua缺失对其毒力的影响本实验分别从RT-PCR法检测毒力基因的转录水平、生长曲线的测定、对DF-1细胞黏附力的比较、LD50的测定、感染动物病理组织切片的观察等方面探索了HPI毒力岛irp2|fyua的缺失对禽致病性大肠杆菌毒力的影响。Real-time PCR结果显示,与野生株相比,irp2fyua缺失株的luxS,pfs, tsh, iss, ompA和fimC等6个毒力基因的转录水平极显著的下降(Pfyua的缺失对禽大肠杆菌在LB培养基的培养条件下生长不会造成影响。对鸡胚层纤维细胞DF-1细胞的黏附结果显示,irp2fyua基因的缺失使APEC的黏附能力下降为野生株的53.5%。irp2|fyua缺失株和irp2缺失株相比,黏附能力下降为后者的14.7倍。罗曼雏鸡的半数致死量检测结果显示,irp2|fyua的缺失使APEC的毒力下降了500倍。罗曼雏鸡心脏和肝脏的病理组织切片显示,irp2|fyua缺失株攻毒后所造成的雏鸡病理变化不明显。通过Red同源重组成功获得APEC irp2和irp2|fyua缺失株,同时irp2和irp2|fyua缺失株的毒力研究结果表明,irp2和irp2|fyua的缺失会引起APEC一止匕毒力因子表达水平的下降、黏附DF-1能力的减弱、LD50的下降以及感染动物病理变化的减轻等。以上结果表明也进一步表明irp2和fyua对于APEC的毒力有着重要的调控作用,为后续明确HPI对APEC的调控作用提供一些参考。

关键词：禽致病性大肠杆菌强毒力岛 irp2 fyua 毒力致病性

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大肠杆菌HPI毒力岛ybtA、fyua基因的研究

大肠杆菌HPI毒力岛ybtA、fyuA基因的研究

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作者：钱金梅扬州大学

学位级别：硕士

由大肠杆菌引起的仔猪腹泻仍是一个没有完全解决的问题,给养猪业带来的损失不可低估;新近发现的携带耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的大肠杆菌使得仔猪腹泻的病原更具复杂性。因此深入研究HPI主要结构基因与HPI毒力岛的关系,以减少HPI毒力岛... 详细信息

由大肠杆菌引起的仔猪腹泻仍是一个没有完全解决的问题,给养猪业带来的损失不可低估;新近发现的携带耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的大肠杆菌使得仔猪腹泻的病原更具复杂性。因此深入研究HPI主要结构基因与HPI毒力岛的关系,以减少HPI毒力岛对养猪业的影响。本实验主要针对ybtA、fyua基因进行研究。在HPI毒力岛中ybtA属AraC转运调节家族。它促进fyua、irp2和irp6启动子的表达却抑制自身启动子。fyua与铁的吸收有关,是Ybt、细菌素以及巴氏杆菌素的外膜受体。为了进一步了解HPI毒力岛的生物学特性,该研究根据GenBank发表的大肠杆菌HPI毒力岛(high pathogenicity island,HPI)主要结构基因fyua、ybtA的基因序列,分别设计一对特异性表达引物,经PCR方法从大肠杆菌HPI毒力岛阳性菌株S711100扩增出fyua 1960 bp、ybtA 840 bp的基因片段,并定向克隆入载体pUCm-T载体,转化大肠杆菌DH5α;经双酶切获得目的片段后,分别插入到表达载体pGEX-6P-1的GST基因下游,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组表达质粒pGEX-6P-1-fyua、pGEX-6P-1-ybtA。诱导表达后重组菌裂解物经SDS-PAGE及Western-blot分析证明,获得的重组表达质粒pGEX-fyua、pGEX-ybtA,分别能够表达分子量为98.37 kDa、60 kDa的蛋白,从而为研制抗GST-fyua、抗GST-YbtA的多克隆抗体提供了抗原。fyua、ybtA基因表达的蛋白都以包涵体形式存在,利用切胶回收的方式纯化表达产物GST-fyua、GST-YbtA作为免疫原,分别免疫2只质量3 kg的雄性新西兰大白兔,进行三次免疫,制备兔抗猪GST-fyua、GST-YbtA蛋白多克隆抗体,用间接ELISA和Western blot进行检测,证明制备的多克隆抗体具有较高的亲和性;可以与GST-fyua、GST-YbtA蛋白特异性结合。为下一步检测fyua、ybtA单基因缺失株提供了多克隆抗体。为了深入研究ybtA、fyua与HPI毒力岛的关系,本实验选择S711100、S793103两株HPI+大肠杆菌菌株为对象,利用Red同源重组技术分别敲出HPI毒力岛的关键基因fyua 50 bp-1972 bp序列和ybtA 50 bp-910 bp序列,构建fyua和ybtA单基因缺失株。通过Western blot方法,用实验中制备的抗GST-YbtA和抗GST-fyua抗体检测ybtA、fyua单基因缺失株及原始菌株S793103菌株蛋白表达情况。以确定fyua和ybtA的缺失对HPI毒力岛相关蛋白表达的影响,结果表明ybtA、fyua在原菌株S793103中表达,但在单基因缺失株中未表达。为进一步研究大肠杆菌高致病性毒力岛(HPI)的致病机理及免疫机理打下了重要基础。

关键词：大肠杆菌 HPI ybtA fyua 表达敲除

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肺炎克雷伯菌铁摄取调节蛋白Fur对耶尔森菌素受体fyua基因的转录调控研究

肺炎克雷伯菌铁摄取调节蛋白Fur对耶尔森菌素受体fyuA基因的转录...

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作者：杜玲重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,KP）是导致院内感染的主要病原菌之一。而铁摄取调节蛋白（Ferric uptake regulator,Fur）作为一个全局性调控因子,影响着毒力基因的表达。通过生物信息学预测分析发现fyua基因启动子区域存在... 详细信息

目的:肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,KP）是导致院内感染的主要病原菌之一。而铁摄取调节蛋白（Ferric uptake regulator,Fur）作为一个全局性调控因子,影响着毒力基因的表达。通过生物信息学预测分析发现fyua基因启动子区域存在Fur的结合位点。fyua与铁的摄取相关,是铁载体耶尔森菌素的外膜受体。本研究旨在探索肺炎克雷伯菌Fur与耶尔森菌素受体fyua之间的调控关系,分析fyua基因对其毒力的影响,进一步了解KP菌的致病机制。方法:首先,采用自杀质粒pKO3-Km构建重组质粒pKO3-Km-Δfyua,将其转入肺炎克雷伯菌NTUH-K2044中,通过同源重组技术并利用蔗糖反向筛选突变株Kp:Δfyua。然后,构建表达质粒p BAD33-C-Δfyua并转入突变株Kp:Δfyua中,经PCR筛选及测序得到回补株Kp:cΔfyua。接着,用CAS检测和结晶紫定量实验对野生株、突变株及回补株铁载体的分泌量和生物膜形成能力进行比较。利用大蜡螟毒力实验分析fyua对KP菌毒力的影响。最后,通过GFP报告基因融合实验、RT-q PCR、凝胶迁移实验（EMSA）和DNase I足迹实验探究铁充足环境下Fur对fyua的转录调控机制。结果:成功构建fyua突变株及回补株。在CAS平板检测中发现fyua基因的缺失使菌株分泌的铁载体增加,而CAS液体检测进一步证实fyua影响KP菌铁载体的生成。结晶紫实验结果表明fyua能够正向影响生物膜的形成。大蜡螟毒力实验表明fyua的缺失可减弱细菌毒力,故fyua对菌株毒力有一定影响。运用GFP报告基因融合实验、RT-q PCR分析得知铁充足环境下,Fur负调控fyua的表达。通过EMSA实验表明Fur能直接结合至fyua的启动子区,DNase I足迹实验进一步得到了具体结合位点的序列。结论:表型实验分析发现fyua可影响KP菌的毒力,在毒力方面发挥一定作用。分子实验明确Fur可与fyua的启动子区结合,进而负调控fyua的转录表达,这为研究Klebsiella pneumoniae的致病机制提供新思路。

关键词：肺炎克雷伯菌铁摄取调节蛋白生物膜 Fur fyua

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