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生物工程学报 2023年第4期39卷 1578-1595页

作者：鲍江舰杨君仪邵瑞瑞张婷廖健程玉梅官志忠齐晓岚陈峥宏洪伟崔古贞贵州医科大学基础医学院贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室贵州贵阳550004 贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室贵州省医学分子生物学重点实验室贵州贵阳550001 省部共建地方病及民族区域性疾病防控协同创新中心贵州贵阳550001 贵州医科大学口腔医学院附属口腔医院贵州贵阳550001 贵州医科大学附属医院综合ICU 贵州贵阳550001 贵州医科大学病理科贵州医科大学附属医院贵州贵阳550001

鞭毛基底体相关flil家族蛋白(flagellar basal body-associated flil family protein,flil)基因编码flil蛋白,flil是一种与鞭毛基体相结合的单跨膜蛋白。为研究艰难拟梭菌flil基因功能,使用非等长同源臂偶联等位交换(allele-coupled exchange,ACE)方法成功构建了flil基因缺失(Δflil)和回补(::flil)突变株,研究突变菌株与野生型菌株(CD630)生长曲线、抗生素敏感性、pH耐受性、运动能力及产孢能力等表型的差异。结果显示,菌株Δflil生长速率及最大生物量均小于菌株CD630,::flil回补菌株生长情况回复至野生型。与CD630菌株相比,Δflil对阿莫西林、氨苄青霉素、诺氟沙星的敏感性提高,对卡那霉素、四环素敏感性降低,::flil抗生素敏感性部分回复至野生型水平。与CD630菌株相比,Δflil游泳运动能力显著降低,::flil运动能力超越野生型菌株CD630。相比菌株CD630,菌株Δflil在pH值为5时耐受能力显著提高,在pH值为9时,耐受能力显著降低。除此之外,Δflil产孢能力较CD630显著降低,::flil产孢能力部分恢复。以上结果表明,艰难拟梭菌flil基因与其运动能力、抗生素敏感性、环境耐受能力和产孢能力密切相关,可能进一步影响艰难拟梭菌菌株的致病力。

关键词：艰难拟梭菌非等长同源臂偶联等位交换鞭毛 flil 突变株表型

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变形假单胞菌flil基因的毒力作用及其对珍珠龙胆石斑鱼免疫应答的影响

变形假单胞菌fliL基因的毒力作用及其对珍珠龙胆石斑鱼免疫应答的...

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作者：石涟集美大学

学位级别：硕士

变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）可导致多种重要养殖经济鱼类在低温条件下爆发流行性疾病,给水产养殖业造成了巨大的经济损失。本实验室前期的dual RNA-seq发现变形假单胞菌flil基因在宿主脾脏中高表达,推测此基因可能与... 详细信息

变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）可导致多种重要养殖经济鱼类在低温条件下爆发流行性疾病,给水产养殖业造成了巨大的经济损失。本实验室前期的dual RNA-seq发现变形假单胞菌flil基因在宿主脾脏中高表达,推测此基因可能与变形假单胞菌的致病性有关。为探究flil基因对变形假单胞菌致病性的贡献及其感染宿主免疫应答的影响,本文构建了变形假单胞菌flil基因缺失突变株（Δflil）及回补株（C-Δflil）,进而比较野生株与Δflil株在生物学性状、半数致死量(LD)、对珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×***♂）的致病性以及抗感染免疫应答等方面的差异。主要结果如下:（1）根据flil基因的序列,利用同源重组技术成功构建了变形假单胞菌flil基因的缺失突变株（Δflil）,并构建了回补菌株（C-Δflil）,用于后续的一系列研究。与变形假单胞菌野生株NZBD9相比,Δflil株和C-Δflil株的生长均没有显著差异,但是Δflil株在LB半固体平板上形成的菌落直径比野生株的菌落直径小14.93%（Pflil株的细胞数量比变形假单胞菌野生株的少47.91%（Pflil株生物膜溶解液的OD比野生株的低22.29%（Pflil株数量比野生株的少,但是没有显著差异。这些结果表明flil基因的敲除能显著性降低变形假单胞菌的运动能力、对珍珠龙胆石斑鱼表皮黏液的黏附能力、生物膜形成能力,而回补flil基因后,C-Δflil菌株均基本恢复了这些能力。人工感染实验结果显示Δflil株的LD比野生株高12倍,而C-Δflil菌株的LD低于野生株。（2）转录组分析发现,Δflil株和野生株的转录组之间存在126个差异表达基因（DEGs）,这些DEGs显著富集到了20个GO term以及KEGG通路中的ABC转运体通路。这些结果表明缺失flil基因能显著降低变形假单胞菌的毒力,主要是通过影响多种物质的运输来实现的。（3）感染相同剂量（5×10～4 CFU/尾）Δflil菌株的珍珠龙胆石斑鱼初次死亡时间比感染野生株延后了一天,存活率提高了50%,并且脾脏白点症状有所减轻。在整个感染过程中,Δflil株在鱼脾脏、肝脏、头肾和肠道中的载量始终低于野生株,且Δflil株感染组的鱼组织损伤较野生株感染组的轻。取感染后第四天（4 dpi）的珍珠龙胆石斑鱼脾脏进行RNA-seq分析,发现flil基因的缺失能够显著影响变形假单胞菌感染后珍珠龙胆石斑鱼的脾脏转录组,DEGs显著富集到与免疫相关的GO term有4个,KEGG免疫通路有7条,Toll样受体信号通路中TLR5的上调表达可激活NF-κB通路和AP-1转录因子,从而诱导趋化因子、促炎细胞因子和其他细胞因子表达上调,引发炎症反应,抵抗细菌感染。综上所述,flil基因参与了调控变形假单胞菌毒力及其对珍珠龙胆石斑鱼的致病性,是变形假单胞菌重要的毒力相关基因。flil基因的缺失能显著影响珍珠龙胆石斑鱼脾脏的转录组,通过激活Toll样受体信号通路等免疫相关通路,激活了宿主对变形假单胞菌的免疫应答。本文的研究结果有助于揭示flil基因在变形假单胞菌致病过程的作用,深化对变形假单胞菌的致病机制的认识,有益于增进对感染后宿主免疫应答的理解。

关键词：水产病害变形假单胞菌 flil 珍珠龙胆石斑鱼免疫应答

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艰难拟梭菌flil、CD630＿RS03050基因工程菌株建立及其生物学功能研究

艰难拟梭菌fliL、CD630＿RS03050基因工程菌株建立及其生物学功能...

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作者：鲍江舰贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:构建艰难拟梭菌flil基因及CD630＿RS03050基因的敲除菌株Δflil及ΔCD630＿RS03050,并在Δflil及ΔCD630＿RS03050基础上构建回补菌株::flil及::CD630＿RS03050。通过比较野生型菌株CD630、敲除菌株(Δflil及ΔCD630＿RS03050)及回补菌株(flil及::CD630＿RS03050)的生理、生化、转录、毒力等方面的差异,探究flil基因及CD630＿RS03050基因在艰难拟梭菌生长、繁殖、毒力及致病中的生物学功能。方法:首先,以艰难拟梭菌pyr F基因为靶基因,采用同源重组方法构建pyr F敲除菌株,作为后续基因研究的底盘细胞;然后,以pyr F突变菌株为基础,利用非等长同源臂偶联等位交换(Allele-coupled exchange,ACE)方法分别构建flil基因和CD630＿RS03050基因缺失菌株?flil和?CD630＿RS03050,以及回补菌株::flil和::CD630＿RS03050;再次,利用生理生化分析技术,分别分析野生菌株CD630、敲除菌株(?flil、?CD630＿RS03050)回补菌株(::flil、::CD630＿RS03050)的表型变化,包括:形态变化、生长速率、抗生素敏感性、p H耐受性、运动能力、产胞特性、产气能力、毒力变化等。最后,为了研究CD630＿RS03050基因突变对艰难拟梭菌转录水平的影响,我们利用高通量转录组测序技术,对野生菌株(CD630)、敲除菌株(?CD630＿RS03050)进行了转录组测序,从转录水平进一步分析CD630＿RS03050基因的功能。结果:采用同源重组技术成功构建艰难拟梭菌pyr F基因突变菌株Δpyr F,以Δpyr F作为底盘细胞采用ACE技术成功获得flil及CD630＿RS03050基因的敲除菌株及回补菌株:?flil、?CD630＿RS03050、::flil及::CD630＿RS03050。艰难拟梭菌flil基因敲除后,Δflil生长速率及最大生物量均小于CD630,::flil回补菌株生长情况回复至野生型。与CD630菌株相比,Δflil对阿莫西林、氨苄青霉素、诺氟沙星的敏感性提高,对卡那霉素、四环素敏感性降低,::flil抗生素敏感性部分回复至野生型水平。另外,Δflil运动能力显著降低,::flil运动能力超越野生型CD630菌株。相比CD630,Δflil在p H为5时耐受能力显著提高,在p H为9时,耐受能力显著降低。除此之外,flil产胞能力较CD630显著降低,::flil产胞能力部分恢复。艰难拟梭菌CD630＿RS03050基因敲除后,ΔCD630＿RS03050菌株的自溶率低于野生型CD630,在耐受抗生素的能力方面与CD630有明显的差异。在运动能力方面,突变菌株表现出较高的运动能力,CD630 RS03050基因回补后运动能力则更接近CD630。突变株产生的气体体积和硫化氢量明显高于CD630,通过细胞毒性实验和Western blot实验验证ΔCD630＿RS03050产生的毒素量降低。当CD630＿RS03050基因被补充后,上述表型均回复或部分回复至野生型。转录组结果进一步验证表型变化提示相较于CD630,ΔCD630＿RS03050突变菌株中246个基因表达下调同时187个基因表达上调。CD630＿RS03050基因功能障碍后,影响到细胞质膜、细胞周边结构、磷壁酸的代谢过程、脂磷壁酸的合成过程和丝氨酸的半胱氨酸生物合成过程等从而导致艰难拟梭菌在表面结构、自溶速率、运动能力、硫化氢产量及毒素释放等表型产生变化。结论:艰难拟梭菌flil基因在其生长繁殖、适应环境、运动及产孢能力均具有重要作用。CD630＿RS03050显著影响菌株自溶、环境耐受能力、运动能力、硫代谢及毒力等生理生化活动。综上,本研究中flil基因和CD630＿RS03050基因调控的生理和生化表型对艰难拟梭菌的感染和复发及其关键,并进一步影响艰难拟梭菌菌株的致病性,本研究可能为艰难拟梭菌的防治提供新的方案。

关键词：艰难拟梭菌基因工程 ACE flil CD630_RS03050

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