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禽腺病毒血清4型fiber-2和penton蛋白亚单位疫苗初步研究及免疫效果评价

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中国兽医学报 2023年第6期43卷 1162-1166,1186页

作者：刘世佳尚宵敏王浩周睿李博硕孙晰瑶韩静静杜恩岐西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

选取禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)JLJ13株的fiber-2和penton蛋白作为保护性抗原,利用SWISS-MODEL网站对fiber-2蛋白空间结构进行模拟,截取其主要功能区fiber-2-Shaft 2替代fiber-2,进行密码子优化后,将fiber-2-Shaft 2和penton蛋白基因序列克隆到pET28a(+)载体上并送至北京天一辉远生物科技有限公司进行基因合成,将合成的质粒分别命名为pET-28a-msyb-fiber-2-Shaft 2和pET-28a-msyb-penton。通过原核表达系统进行蛋白表达并使用镍柱纯化。经BCA定量后,用PBS分别将fiber-2-Shaft 2和penton蛋白质量浓度稀释至1000,500,250 mg/L,再将相同质量浓度的fiber-2-Shaft 2和penton蛋白按1∶1体积比混合后作为抗原,配伍ISCOMs佐剂,0.2 mL/只免疫30日龄SPF鸡,即高剂量组免疫fiber-2-Shaft 2和penton蛋白各100μg、中剂量组各50μg、低剂量组各25μg。一免后14 d进行二次免疫,采集二免后7,14,21 d血清检测特异性抗体和中和抗体,并在二免后21 d攻毒。结果显示,成功表达出fiber-2-Shaft 2和penton蛋白,大小分别为69,93 kDa,镍柱纯化后可获得高纯度的蛋白;二免后14 d高中低量组的中和效价依次为1280,640,640,攻毒后阴性对照组表现出明显的临床症状,2~3 d后死亡,疫苗组均未出现任何临床症状。结果表明,利用禽腺病毒血清4型JLJ13株fiber-2-Shaft 2和penton蛋白混合配伍ISCOMs佐剂制备的亚单位疫苗免疫保护效果明显。

关键词：禽腺病毒血清4型 fiber-2 penton 亚单位疫苗免疫效果评价

FAdV-4 fiber-2抗体ELISA检测方法的建立

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FAdV-4 Fiber-2抗体ELISA检测方法的建立

作者：刘璐山西农业大学

学位级别：硕士

禽腺病毒(Fowl Adenoviruses,FAdVs)在世界养禽国家广泛分布,其中影响最多、最严重的是FAdV-4型(Fowl Adenovirus serotype 4),可引起肝炎-心包积液综合征(Hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)。自2015年以来,我国各地陆续爆发此病,给我国养禽业带来很大损失。目前对FAdV-4血清抗体检测方法报道较少,因此,需要研发一种检测FAdV-4抗体的ELISA方法。本研究将fiber-2全基因克隆入pET-32a表达载体,构建了pET32a-fiber2原核表达质粒,进行了目的蛋白的表达和纯化,并利用纯化的蛋白建立了FAdV-4 fiber2抗体ELISA检测方法。1.将pET32a-fiber2表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),进行原核表达。fiber-2蛋白诱导表达的IPTG最佳浓度为0.1 mmol/L、最佳诱导时间为10 h。SDS-PAGE证明fiber-2蛋白主要以包涵体的形式存在。目的蛋白纯化后浓度为1.5 mg/m L。Western Blot证实fiber-2蛋白具有良好的反应原性,可与FAdV-4抗体反应产生单一条带。表明纯化fiber-2蛋白可作为ELISA包被抗原检测血清抗体。2.将纯化的fiber-2蛋白作为包被抗原,建立了FAdV-4抗体ELISA检测方法。ELISA方法的优化条件为:抗原最佳包被浓度为1.25μg/m L,包被液为p H 7.2碳酸盐缓冲液,抗原包被时间为37℃1 h后4℃过夜,封闭液为5%脱脂乳,血清和酶标二抗稀释液为5%脱脂乳,血清最佳稀释度为1∶200,血清最适作用时间为37℃15 min,酶标二抗最佳稀释度为1∶7500,酶标二抗最适作用时间为37℃60 min。ELISA方法的临界值为0.104,大于等于0.104为阳性,小于0.104为阴性。3.建立的ELISA方法与其他阳性血清不发生特异性反应,特异性好;检测敏感度高,可达1∶12800;组内与组间试验的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。抗原包被酶标板在4℃条件下保存6个月,其特异性和敏感性均保持良好。建立的ELISA与血清病毒中和试验(VNT)检测结果一致,具有很高的可靠性。本研究用原核表达、纯化的fiber-2蛋白成功建立了一种特异性好、敏感度高、重复性好、可靠性高的FAdV-4 fiber-2抗体ELISA检测方法,为FAdV-4流行病学调查及疫苗免疫效果评估提供了有效手段。

关键词：禽腺病毒 fiber-2 原核表达间接ELISA

血清4型禽腺病毒fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备

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基于抗原蛋白fiber-2及细胞因子佐剂的Ⅰ群4型禽腺病毒亚单位疫苗的开发

南方农业学报 2022年第8期53卷 2341-2349页

作者：韦悠谢芝勋邓显文李小凤谢志勤范晴张艳芳黄娇玲王盛广西兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室广西南宁 530001

【目的】获得截短表达的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)fiber-2重组蛋白及其单克隆抗体,为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。【方法】对fiber-2基因序列进行密码子优化,截取fiber-2蛋白抗原性集中片段,PCR扩增其基因序列,连接至pET-32... 详细信息

【目的】获得截短表达的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)fiber-2重组蛋白及其单克隆抗体,为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。【方法】对fiber-2基因序列进行密码子优化,截取fiber-2蛋白抗原性集中片段,PCR扩增其基因序列,连接至pET-32a(+)构建原核表达载体。将表达的重组蛋白进行纯化,并通过Western blotting验证其在大肠杆菌中的表达情况。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠后取脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选阳性细胞株,再利用秋水仙素裂解法、间接ELISA法和间接免疫荧光法(IFA)对其进行鉴定。【结果】成功构建fiber-2基因截短片段的原核表达系统,获得大小约为67 kD的fiber-2截短蛋白,以包涵体的形式出现,经纯化后可获得单一的特异性条带,经Western blotting鉴定证明其可与FAdV-4阳性血清结合从而产生一条特异性条带。经过4次亚克隆后筛选到5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株(2C2、4F6、5A5、6G10和10B5),其抗体分泌稳定性、特异性好,诱生的细胞上清液抗体效价为1:1600~1:6400,腹水抗体效价为1:320000~1:1280000,秋水仙素裂解检测染色体数目为94~110条。2C2、4F6和10B5杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG2b亚型,轻链为Kappa链;5A5和6G10杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG1亚型,轻链为Kappa链。5株杂交瘤细胞株与感染FAdV-4的鸡肝癌上皮细胞系(LMH)进行IFA检测,结果均为阳性。【结论】制备的fiber-2截短重组蛋白及单克隆抗体具有良好的反应原性和特异性,可用于FAdV-4病毒检测试剂盒研发。

关键词：血清4型禽腺病毒(FAdV-4) fiber-2 基因克隆重组蛋白单克隆抗体 Western blotting

来源：博看期刊评论

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中国兽医科学 2020年第4期50卷 452-458页

作者：匡露寒季国荣杨灿灿张元兴刘琴华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 上海海洋动物疫苗工程技术研究中心上海200237

为了开发一种抗I群4型禽腺病毒(FAd V-4)的亚单位疫苗,选择I群禽腺病毒血清4型流行毒株衣壳蛋白fiber-2作为保护性抗原蛋白。利用昆虫细胞-杆状病毒系统生产fiber-2蛋白,通过Westernblot检测重组蛋白的表达情况,利用双向琼脂扩散法检测... 详细信息

为了开发一种抗I群4型禽腺病毒(FAd V-4)的亚单位疫苗,选择I群禽腺病毒血清4型流行毒株衣壳蛋白fiber-2作为保护性抗原蛋白。利用昆虫细胞-杆状病毒系统生产fiber-2蛋白,通过Westernblot检测重组蛋白的表达情况,利用双向琼脂扩散法检测重组fiber-2的免疫原性。为了增强亚单位疫苗的免疫保护效果,添加鸡源白细胞介素2(chIL-2)和鸡源γ-干扰素(ch IFN-γ)作为免疫佐剂,与重组fiber-2单独或混合使用,制备多种形式的亚单位疫苗,并进行动物攻毒保护试验。重组蛋白的Western-blot鉴定结果显示,63 ku处出现fiber-2蛋白目的条带;双向琼脂扩散试验结果显示,重组蛋白效价达到1∶128,表现出良好的反应原性。动物攻毒保护试验结果显示,单独使用fiber-2免疫SPF鸡,在50 μg/只的剂量下,可为SPF鸡提供100%的保护效果,以chIL-2和chIFN-γ为免疫佐剂,与重组fiber-2联合免疫SPF鸡,可显著增强fiber-2在低剂量(10 μg/只)下的免疫保护效果,上述结果表明重组fiber-2联合chIL-2和chIFN-γ细胞因子佐剂所制备的亚单位疫苗在抗I群4型禽腺病毒感染领域具有良好的应用前景。

关键词： I群4型禽腺病毒 fiber-2 chIL-2 chIFN-γ 亚单位疫苗

基于血清4型禽腺病毒fiber-2间接ELISA方法的建立

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中国预防兽医学报 2019年第8期41卷 807-811页

作者：梅楠孙海伟李允章汪凯王桂军陈鸿军安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为建立一种快速监测鸡群中血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的方法,本研究通过PCR扩增FAd V-4 AQ强毒株的fiber-2基因截短体(112 bp^1 440 bp),克隆至p ET-32a(+)载体中进行原核表达,以重组表达的fiber-2蛋白作为包被抗原,经优化反应条件,建立... 详细信息

为建立一种快速监测鸡群中血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的方法,本研究通过PCR扩增FAd V-4 AQ强毒株的fiber-2基因截短体(112 bp^1 440 bp),克隆至p ET-32a(+)载体中进行原核表达,以重组表达的fiber-2蛋白作为包被抗原,经优化反应条件,建立了快速检测FAd V-4的间接ELISA方法,该方法特异性试验结果显示,除FAd V-4外,与其它病原无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法检测血清最低稀释度为1∶12 800,具有较高的敏感性;重复性试验结果显示,该方法批内、批间变异系数均小于10%。该方法对FAd V-4临床感染的阳性血清检出率为100%,与琼脂扩散试验结果完全吻合。本研究建立的以fiber-2重组蛋白为包被抗原的间接ELISA方法能够用于FAd V-4灭活疫苗免疫后的血清学调查。

关键词：血清4型禽腺病毒 FAdV-4 fiber-2 原核表达间接ELISA

基于血清4型禽腺病毒变异株Hexon和fiber-2 ELISA检测方法的建立与应用

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基于血清4型禽腺病毒变异株Hexon和Fiber-2 ELISA检测方法的建立...

作者：梅楠安徽农业大学

学位级别：硕士

2015年以来,由Ⅰ群禽腺病毒(group Ⅰ Fowl Adenovirus,FAdV-Ⅰ)引起的家禽心包积液综合征(Hydropericardium syndrome,HPS)以及包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis,IBH)给我国的养殖业造成巨大损失,其中以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为我国主要流行血清型。该病发病急、病程短、死亡率高,给家禽养殖带来了严重危害。Hexon和fiber-2是血清4型禽腺病毒的两个主要结构蛋白,Hexon上分布着不同的特异性抗原表位,这其中就有病毒中和抗体的区域;fiber-2含有与病毒毒力以及细胞表面受体相关的表位。为了能及时快速对鸡群感染状况进行监测,减少经济损失,本研究以实验室分离保存的一株Ⅰ群血清4型禽腺病毒为研究对象,建立Hexon和fiber-2的间接ELISA检测方法,以期用于临床诊断监测及该病的预防。1、Hexon单克隆抗体抗原表位鉴定及检测方法建立基于本实验室已经制备的一株针对Hexon截短体(命名为Hexon879bp)的单抗1B4,为了确定该单抗的抗原表位,本研究将该截短体根据疏水区和亲水区分析出可能的抗原位点区域,分别设计引物,扩增每个小片段,亚克隆入原核表达载体中,诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果显示:单抗1B4针对的抗原位点在210～219aa之间(即对应在hexon基因的630bp～657bp之间)。为了建立基于Hexon为包被抗原的ELISA检测方法,本研究利用两种包被抗原进行检测方法的建立:1)合成该抗原表位多肽,利用钥孔血蓝蛋白(KLH)耦联。以耦合的多肽片段作为包被抗原,建立ELISA检测方法。结果显示,当多肽包被浓度为5μg/100μL时,检测结果最佳;2)通过蛋白纯化原核表达在包涵体中的Hexon879抗原,利用矩阵法确定最佳蛋白包被浓度为0.1μg/100μL,单抗最佳稀释倍数为1:2000。结果显示,蛋白包被浓度为0.1μg/100μL时,检测免疫禽腺病毒灭活苗的鸡血清抗体,与禽腺病毒抗体检测试剂盒相比,检出阳性率为100%。该方法为血清4型禽腺病毒的实验室和临床诊断提供了重要的参考。2、血清4型禽腺病毒fiber-2抗体检测方法建立基于FAdV-4 AQ株(登录号:KY436520)的fiber-2基因5’端111bp的高亲水区域影响该蛋白在pET32a(+)载体中的表达效率,本实验从fiber-2 5’端112bp处开始设计一对特异性引物,PCR扩增fiber-2△N序列,即112-1440bp片段,与pET32a(+)载体连接,测序正确的阳性质粒命名为pET-32a-fiber2AN,将阳性质粒转入表达菌BL21(DE3),表达的fiber-2△N蛋白经SDS-PAGE验证大小正确,纯化表达在包涵体中的蛋白,纯化后作为检测抗原包被,建立间接ELISA方法,并对试验条件进行优化。结果显示,fiber-2△N蛋白最佳包被浓度为0.1μg/100μL,特异性和重复性良好。与琼扩实验相比,该方法对免疫血清4型禽腺病毒灭活苗的鸡血清抗体检测率符合率为100%。3、血清4型禽腺病毒灭活疫苗血清抗体检测方法比较将本实验室制备的FAdV-4AQ株病毒经灭活、乳化,制备获得灭活疫苗,免疫7日龄的SPF鸡,一周后颈静脉采血,连续采集八周。分别用Hexon879 ELISA检测法、多肽ELISA检测法、fiber-2 ELISA检测法以及Ⅰ群禽腺病毒检测试剂盒检测血清中抗体水平,比较几种检测方法的检测效果。结果显示,建立的Hexon879 ELISA检测法及多肽ELISA检测法都有较好的检出率。取ELISA检测阳性的血清10份进行琼脂扩散实验。结果显示,琼脂扩散试验结果与本实验建立的Hexon879 ELISA检测法、Hexon 210-219aa多肽ELISA检测法、fiber-2 ELISA检测法以及Ⅰ群禽腺病毒检测试剂盒检测结果完全相符。这表明这些方法对禽腺病毒的临床检测以及疫苗效价评估提供了可行方法。

关键词：血清4型禽腺病毒抗原表位多肽ELISA Hexon fiber-2 灭活苗

杆状病毒表达的禽腺病毒4型fiber-2蛋白免疫效果研究

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杆状病毒表达的禽腺病毒4型Fiber-2蛋白免疫效果研究

作者：王晨山西农业大学

学位级别：硕士

禽腺病毒(Fowl Adenovirus,FAd V)分为Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群。Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型均可引起禽心包积液-包涵体肝炎综合征(HPS-IBH),其中FAd V-4型是最常见的致病病原。近年来,国内由FAd V-4引起的HPS-IBH发病率逐渐上升,给养禽业造成... 详细信息

禽腺病毒(Fowl Adenovirus,FAd V)分为Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群。Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型均可引起禽心包积液-包涵体肝炎综合征(HPS-IBH),其中FAd V-4型是最常见的致病病原。近年来,国内由FAd V-4引起的HPS-IBH发病率逐渐上升,给养禽业造成了巨大的经济损失。目前国内尚没有商品化的疫苗用于控制FAd V-4感染,因此,开展FAd V-4疫苗研究具有重要意义。本研究将FAd V-4的fiber-2蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中进行表达,研究fiber-2蛋白的免疫效果,为禽腺病毒基因工程亚单位疫苗的研究提供依据。构建了含fiber-2基因的供体质粒,将其转化DH10Bac菌株,通过蓝白斑筛选出阳性重组杆粒(Bacmid)。将Bacmid转染sf9细胞后获得重组杆状病毒,采用悬浮放大培养工艺表达重组fiber-2蛋白。将sf9细胞表达上清液分别通过镍柱纯化和超滤管浓缩的方式获得目的蛋白。Western-Blot结果显示,成功获得纯化和浓缩的fiber-2蛋白。蛋白浓度测定结果显示,纯化蛋白含量为120μg/m L、浓缩总蛋白中目的蛋白的含量为114μg/m L。将纯化和浓缩的fiber-2蛋白分别设置5μg、1μg加佐剂和5μg未加佐剂的免疫剂量用于免疫21日龄的雏鸡,同时用未感染重组杆状病毒的sf9细胞上清液与佐剂混合作为对照。免疫后7 d、14 d、21 d、28 d使用实验室建立的FAd V-4抗体ELISA检测方法,检测抗体的OD变化。结果显示,免疫后14 d纯化和浓缩免疫组均检测到血清抗体,免疫后21 d各免疫组的抗体水平达到峰值。t检验结果显示,纯化与浓缩fiber-2蛋白免疫后抗体水平无显著差异(P>0.05),但5μg佐剂组的抗体水平最高,1μg佐剂组次之。免疫后28 d通过肌肉注射和经口灌服进行攻毒,结果显示:纯化5μg、1μg和浓缩5μg、1μg加入佐剂后都能提供100%的免疫保护率,而浓缩5μg不加佐剂对经口灌服FAd V-4毒株的攻击,也能提供100%的保护。结果说明,纯化与浓缩fiber-2蛋白免疫鸡均可产生抗体,并获得攻毒保护,浓缩的fiber-2蛋白节省了蛋白的纯化成本,更适合临床应用。

关键词：杆状病毒表达系统 FAdV-4 fiber-2 sf9细胞

禽腺病毒血清4型山西株分离鉴定及其fiber-2蛋白的体外表达

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禽腺病毒血清4型山西株分离鉴定及其Fiber-2蛋白的体外表达

作者：张丹山西农业大学

学位级别：硕士

禽腺病毒血清4型病毒(FAdV-4)可引起鸡发生以心包积液和肝炎为特征的疾病,称为心包积液-肝炎综合征,因其发现地为巴基斯坦安卡拉地区所以又称安卡拉病。近些年,我国不同省份都有关于此病报道,发病和死亡情况不尽相同,给养禽业造成了巨... 详细信息

禽腺病毒血清4型病毒(FAdV-4)可引起鸡发生以心包积液和肝炎为特征的疾病,称为心包积液-肝炎综合征,因其发现地为巴基斯坦安卡拉地区所以又称安卡拉病。近些年,我国不同省份都有关于此病报道,发病和死亡情况不尽相同,给养禽业造成了巨大经济损失。本研究从山西某养鸡场采集疑似感染安卡拉病的病鸡肝脏,使用特异性引物扩增出了FAdV-4的六邻体(Hexon)片段,鉴定为FAdV-4感染。取FAdV-4阳性肝脏病料处理后接种SPF鸡胚,盲传三代后收获尿囊液,获得纯种病毒。提取尿囊液DNA扩增FAdV-4的fiber-2片段,分析其与其他FAdV-4分离株的同源性。运用杆状病毒昆虫细胞表达系统,成功表达了fiber-2蛋白,为进一步制备禽腺病毒新型疫苗及相关研究奠定了基础。1.提取疑似患病鸡只肝脏DNA,采用特异性引物对FAdV-4 Hexon片段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳后在900 bp附近出现目的条带。产物测序后,经NCBI数据库中进行序列比对,与已公布禽腺病毒Ⅰ群血清4型Hexon基因序列同源性达到99.9%,确定为FAdV-4感染。2.取确定为FAdV-4感染的病鸡肝脏,处理后接种7日龄SPF鸡胚的卵黄囊,盲传三代后鸡胚出现明显病变;取尿囊液,提取DNA进行PCR检测,产物经琼脂糖凝胶电泳后在900 bp附近出现目的条带,表明FAdV-4分离成功,命名为FAdV4-SX株。3.设计扩增FAdV-4 fiber-2片段的特异性引物,以尿囊液DNA为模板进行PCR检测,产物经琼脂糖凝胶电泳后在1400 bp附近出现目的条带,产物测序后经NCBI数据库中与国内外禽腺病毒分离株进行比对分析。结果:FAdV4-SX株fiber-2片段与国内近几年分离株大多相似度在100%,无变异。通过系统发育树可以看到FAdV4-SX株与国内各省分离株在同一分支,距离较近。与国外分离株如匈牙利(登录号AF036092.3)不在同一分支,距离较远。4.利用杆状病毒表达系统构建了含fiber-2基因的重组杆状病毒穿梭载体,将其转染SF9细胞后获得重组杆状病毒,并采用悬浮放大工艺表达重组fiber-2蛋白。可溶性分析表明重组fiber-2蛋白主要以分泌形式进行表达,利用Ni亲和层析法分离纯化目的蛋白,纯化后的fiber-2蛋白可以与His标签抗体产生特异性结合,说明成功表达了重组fiber-2蛋白。

关键词： FAdV-4 病毒分离 fiber-2 杆状病毒表达系统

血清4型禽腺病毒HN株纤突蛋白fiber-2抗体及亚单位疫苗制备

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血清4型禽腺病毒HN株纤突蛋白Fiber-2抗体及亚单位疫苗制备

作者：张幸星南京农业大学

学位级别：硕士

鸡的I群禽腺病毒(Fowl adenovirus group I,FAdV-I)分为12个血清型,共包含5个亚群,分别是:A亚群(FAdV-1)、B亚群(FAdV-5)、C亚群(FAdV-4和FAdV-10)、D 亚群(FAdV-2、FAdV-3、FAdV-9 和 FAdV-11)和 E 亚群(FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a和FAdV-8b)。2015年之前,这些血清型的禽腺病毒在不同国家均有报道,呈现零星发病或亚临床感染状态。而从2015年夏季开始,我国华东地区的鸡群发生了一种急性包涵体肝炎-心包积液综合征,该病由血清4型禽腺病毒流行株引发,迅速蔓延至全国各省的家禽、水禽之中,对我国养禽业造成了重大的损失。衣壳是禽腺病毒的表面抗原,主要由3种结构蛋白组成,分别是五邻体、六邻体和纤突蛋白(fiber-1、fiber-2)。纤突蛋白fiber-2位于禽腺病毒的表面,头大身细,状如火柴。纤突蛋白能够识别宿主细胞的特异性受体,从而使病毒通过吸附作用结合到宿主细胞的表面。本研究根据GenBank发布的FAdV-C群血清4型ON1毒株的fiber-2基因核苷酸序列设计了一对引物。以最近分离的流行株(HN株)的DNA作为PCR模板,扩增出大小为1440 bp的特异性片段。将该片段克隆到pCold-TF原核表达载体中,转化到宿主菌DH5α感受态细胞内,经测序验证后,命名为pCold-fiber-2。随后,将pCold-fiber-2转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,挑选阳性克隆,16℃低温摇菌,再加入IPTG以诱导目的蛋白的表达。超声波裂解菌体后进行SDS-PAGE分析,鉴定表达获得的特异性条带。为了便于检测,本研究设计了一对引物将fiber-2基因片段构建到真核表达载体pcDNA3中,命名为pcDNA3-fiber-2。将pcDNA3-fiber-2转染入293T细胞中,真核表达fiber-2。36h后弃去培养基,加入2×SDS-PAGE上样缓冲液收集细胞,超声波裂解。经蛋白免疫印迹(WB)验证,fiber-2蛋白成功表达。用原核表达的fiber-2免疫六周龄雌性Balb/c小鼠,经过四次免疫后,检测小鼠多抗血清的IFA或WB效价。挑选阳性效价最高的一只小鼠,进行加强免疫一次。72 h后将该受免小鼠的脾脏小心分离,收集脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用HAT选择培养基、ELISA和IFA筛选出阳杂交瘤细胞株,有限稀释法二次亚克隆获得稳定的杂交瘤细胞株,命名为1B5、1C6、2A9和3H11,其中1C6具有WB效价。将原核表达的fiber-2蛋白作为亚单位疫苗进行攻毒保护试验,分为1次免疫组和2次免疫组。结果发现:攻毒未接种疫苗组全部死亡,而攻毒接种疫苗组全部存活。可见,fiber-2亚单位疫苗拥有良好的免疫保护效果。针对fiber-2的研究将为进一步探索血清4型禽腺病毒的免疫学功能、发病机制和临床快速诊断等奠定基础。

关键词：禽腺病毒 FAdV fiber-2 原核表达单克隆抗体