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生物工程学报 1989年第3期5卷 214-220页

作者：赵扬 P.Tenning 中国科学院昆明植物研究所 PGS遗传工程公司

利用Tn5诱导突变,DNA分子杂交及克隆技术发现并证实了草生欧文氏菌Erwinia herbicola CSH1065fib(Fungiinhibition)基因定位于其180kb质粒上,包含彼此分离的8.3、8.5、8.6和9.5kb EcoRⅠ片段,建立了CSH1065质粒基因组pBR325及pLAFB1基因... 详细信息

关键词：欧文氏菌 fib基因 Tn5诱导突变

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蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1细胞骨架相关基因的研究

蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1细胞骨架相关基因的研究

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作者：周丹霞南京农业大学

学位级别：硕士

螺原体属于柔膜菌纲,不似其他细菌有细胞壁,但是它仅靠单层膜即能维持螺旋状的特殊形态和运动形式,它是研究运动性的模式生物,研究它的形态和运动对深入了解生物的基本规律有极其重要的意义。细胞的形态和运动方式与其细胞骨架有关,fib... 详细信息

螺原体属于柔膜菌纲,不似其他细菌有细胞壁,但是它仅靠单层膜即能维持螺旋状的特殊形态和运动形式,它是研究运动性的模式生物,研究它的形态和运动对深入了解生物的基本规律有极其重要的意义。细胞的形态和运动方式与其细胞骨架有关,fib基因是螺原体中特有的基因,其编码的fib蛋白是螺原体细胞骨架的主要组成部分。mreB基因是编码细胞骨架蛋白的相关基因之一,其编码的MreB蛋白有维持螺原体独特的螺旋细胞结构的作用。因此研究螺原体细胞骨架相关基因mreB、fib有助于进一步认识螺原体的形态变化和运动的机制。本研究在测定蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1基因组序列的基础上,应用生物信息学方法分析细胞骨架相关基因mreB和fib、研究mreB基因的外源表达情况,以及螺原体在非螺旋状和螺旋状时mreBfib基因的表达差异,为今后深入研究MreB体外聚合作用,进一步研究其在体内的聚合特点,以及mreB、fib基因的功能分析奠定基础。主要研究结果有：第一、螺原体CH-1中含有5个mreB基因、1今力b基因,利用生物信息学的方法,对mreB1-mreB5和,fib所编码的蛋白质进行分析,结果表明：(1)MreB1-MreB5的分子量分别为36、23、23、37、25 kD,其中MreB1的分子量与其他细菌(如.Escherichia coli)中的分子量一致,均为36 kD,预测fib分子量为58 kD,与其他研究者所报道的大小相似;(2)MreB蛋白属于MreB/Mbl蛋白质家族,fib蛋白的N端(14-226的氨基酸位置)预测属于磷酸化酶家族(Phosphorylase superfamily),与Cohen-Krausz等的预测结果相似。(3)利用SWISS-MODEL自动同源建模,预测了螺原体CH-1 MreB蛋白的三维立体结构,发现MreB1、MreB4、MreB5的蛋白结构相似,有细微的差异,MreB2和MreB3的蛋白结构相近,存在较小差异。fib由于是螺原体中独特的蛋白,并不能根据同源建模的方法得到整个蛋白的三维结构。(4)S. melliferum CH-1的MreB氨基酸与其他细菌的系统发育树显示,MreB1-MreB5分别与其他螺原体相对应的MreB蛋白亲缘关系较近。第二、根据螺原体CH-1全基因组测序得到的细胞骨架相关基因mreB序列设计引物,首次克隆了螺原体的mreB1-mreB5基因,利用大肠杆菌表达系统(表达质粒为pET-28a)表达纯化了MreB蛋白。在蛋白纯化时发现E. coil所表达的螺原体CH-1MreB1-MreB5目的蛋白存在于包涵体之中,需用含8 mol/L尿素的Binding Buffer才能溶解,属于疏水性蛋白质,结合生物信息学分析,推测表达的螺原体CH-1中的MreB蛋白可能都是疏水性蛋白,为今后研究MreB体外聚合作用以及进一步研究其在体内的聚合特点奠定基础。第三、螺原体CH-1在培养过程中形态有明显的变化,用暗视野显微镜观察在延滞前期绝大部分螺原体成小点状,对数生长期螺原体绝大多数呈螺旋状,而在电镜下观察暗视野显微镜下成小点状的螺原体则呈各种不规则的近球形,或末端膨大的稍弯曲的杆状。利用二步法的real-time PCR方法,以SYBR Green I染料法相对定量螺原体CH-1在螺旋状和非螺旋状时mreB1-mreB5、fib基因的表达,结果表明：(1)mreB1-mreB5和归基因在非螺旋状时的表达量相对于螺旋状时表达量存在显著差异。螺原体在典型的螺旋形时,mreB、fib基因的表达量比螺原体在非螺旋状时表达量显著提高,初步表明螺原体CH-1维持螺旋形需要mreB和fib基因的参与,这些细胞骨架相关基因可能与螺原体的形态相关;(2)螺原体从非螺旋状生长到螺旋状期间,fib基因表达的增幅水平大于mreB基因表达的增幅水平。推测对于螺原体CH-1螺旋形态的维持fib基因可能比mreB基因作用明显,所以mreB、fib基因的功能有待进一步验证。本研究结果为今后进一步确定这些基因在蜜蜂螺原体CH-1形态和运动性方面的作用提供了重要信息,为进一步研究基因的功能奠定基础。

关键词：螺原体CH-1 细胞骨架生物信息学 mreB基因 fib基因表达量

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