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exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription

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Neural Regeneration Research 2012年第14期7卷 1064-1072页

作者： Stephen Johnston Zachary Gallaher Krzysztof Czaja Programs in Neuroscience and Department of Veterinary and Comparative Anatomy Pharmacology and Physiology College of Veterinary Medicine Washington State University Pullman WA 99164-6520 USA

Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction （qPCR） is widely used to investigate transcriptional changes following experimental manipulations to the nervous system. Despite the widespread utilization of qPCR, the interpretation of results is marred by the lack of a suitable reference gene due to the dynamic nature of endogenous transcription. To address this inherent deficiency, we investigated the use of an exogenous spike-in mRNA, luciferase, as an internal reference gene for the 2ct normalization method. To induce dynamic transcription, we systemically administered capsaicin, a neurotoxJn selective for C-type sensory neurons expressing the TRPV-1 receptor, to adult male Sprague-Dawley rats. We later isolated nodose ganglia for qPCR analysis with the reference being either exogenous luciferase mRNA or the commonly used endogenous reference 13-111 tubulin. The exogenous luciferase mRNA reference clearly demonstrated the dynamic expression of the endogenous reference. Furthermore, variability of the endogenous reference would lead to misinterpretation of other genes of interest. In conclusion, traditional reference genes are often unstable under physiologically normal situations, and certainly unstable following the damage to the nervous system. The use of exogenous spike-in reference provides a consistent and easily implemented alternative for the analysis of qPCR data.

关键词： exogenous reference gene sensory ganglia reverse transcription-polymerase chain reaction normalization injury neural regeneration

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