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Diagnosis of Bovine Tuberculosis by Comparative Intradermal Tuberculin Test, Interferon Gamma Assay and <i>esxb</i>(CFP-10) PCR in Blood and Lymph Node Aspirates

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Open Journal of Veterinary Medicine 2019年第5期9卷 55-65页

作者： Derhasar Brahma Deepti Narang Mudit Chandra Gursimran Filia Amarjit Singh Sikh Tejinder Singh Department of Veterinary Microbiology College of Veterinary Science Guru Angad Dev Veterinary and Animal Sciences University Ludhiana Punjab India Department of Veterinary Microbiology College of Veterinary ScienceGuru Angad Dev Veterinary and Animal Sciences University Ludhiana Punjab India Animal Disease Research Centre College of Veterinary Science Guru Angad Dev Veterinary and Animal Sciences University Ludhiana Punjab India Department of Veterinary Pathology College of Veterinary Science Guru Angad Dev Veterinary and Animal Sciences University Ludhiana Punjab India Directorate Livestock Farm College of Veterinary Science Guru Angad Dev Veterinary and Animal Sciences UniversityLudhiana Punjab India

Bovine tuberculosis (TB) is a chronic debilitating disease of huge economic importance due to loss in production, morbidity and mortality, and has a potential zoonotic threat. TB is endemic in India and has a worldwide prevalence, therefore, needing early diagnostic technique for the eradication of TB globally. Currently, compared to the eradication programme of TB in Medical sector, Veterinary sector is lagging behind though TB is one of the major zoonotic diseases prevalent in dairy animals and wildlife in India. With the “End TB” strategy by WHO in human, parallel measures for early diagnosis and culling has to be followed in case of animals for an overall successful eradication programme. The objective of this study is diagnosis of TB in cattle and buffaloes by using the cell-mediated immune response tests, i.e. Comparative Intradermal Tuberculin Test (CITT) and Interferon gamma (IFN-γ) assay, and Polymerase Chain Reaction (PCR) targeting esxb gene (CFP-10 protein) and to compare their diagnostic capabilities. This study was carried out in 202 dairy cattle and buffaloes from an organized dairy farm, where almost all of the animals appeared clinically healthy. We found that, the combined use of both CITT and IFN-γ assay lead to more accurate diagnosis of TB, although IFN-γ assay was more specific than CITT. However, esxb PCR showed almost similar sensitivity to IFN-γ assay and may be used as a fast alternative method for the diagnosis of bovine TB from blood samples.

关键词： Bovine TB CITT IFN-γ esxb PCR

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三种非结核分枝杆菌esxb基因的克隆与序列分析

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黑龙江畜牧兽医 2017年第3期 19-23,289,290页

作者：管清华朱世馨钱爱东吉林农业大学动物科技学院长春130118

为了探讨非结核分枝杆菌中esxb蛋白的生物学功能,试验以实验室分离的母牛分枝杆菌、新金分枝杆菌和耻垢分枝杆菌为对象,克隆了esxb基因,应用生物信息学方法进行系统发生分析,对esxb蛋白进行生物学特性、保守区分析以及抗原表位、可能的... 详细信息

为了探讨非结核分枝杆菌中esxb蛋白的生物学功能,试验以实验室分离的母牛分枝杆菌、新金分枝杆菌和耻垢分枝杆菌为对象,克隆了esxb基因,应用生物信息学方法进行系统发生分析,对esxb蛋白进行生物学特性、保守区分析以及抗原表位、可能的三级结构预测。结果表明:克隆的3种非结核分枝杆菌的esxb基因大小分别为309 bp、303 bp、294 bp,推导的氨基酸序列与Gen Bank中登录的相应菌种的氨基酸序列同源性分别为95%或97%、100%、100%;属于WXG100蛋白超家族中CFP-10亚家族成员,具有该亚家族保守的α-螺旋和Yxxx D/E序列;预测到3条肽链线性B细胞表位各1个,T细胞表位各4个、9个、5个,部分T细胞表位与结核杆菌CFP10的CD8+T细胞表位有5~6个共同氨基酸。

关键词：新金分枝杆菌母牛分枝杆菌耻垢分枝杆菌 esxb 表位

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金黄色葡萄球菌亚单位疫苗EsxA-esxb-Flic载体构建及蛋白表达纯化

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黑龙江畜牧兽医 2016年第4期 43-46页

作者：李飞达潘伟荣肖晶刘海京袁玉梅刘欢魏强张兴举深圳华大基因研究院广东深圳518083 云南农业大学版纳微型猪近交系研究所昆明650201 深圳华大方舟生物技术有限公司广东深圳518083

为了预防金黄色葡萄球菌感染,减少畜牧业的经济损失,试验采用鞭毛蛋白Flic与金黄色葡萄球菌毒力因子EsxA、esxb组成2 133 bp的融合基因Esx A-Esx B-Flic,在大肠杆菌内扩增表达质粒,裂解细菌后提取总蛋白,再通过His标签纯化出Esx A-Esx B... 详细信息

为了预防金黄色葡萄球菌感染,减少畜牧业的经济损失,试验采用鞭毛蛋白Flic与金黄色葡萄球菌毒力因子EsxA、esxb组成2 133 bp的融合基因Esx A-Esx B-Flic,在大肠杆菌内扩增表达质粒,裂解细菌后提取总蛋白,再通过His标签纯化出Esx A-Esx B-Flic融合蛋白。结果表明:该方法简单高效,能快速获得大量纯化的目的蛋白,可用于新型抗金黄色葡萄球菌融合蛋白亚单位疫苗研究。

关键词：金黄色葡萄球菌融合蛋白 EsxA esxb Flic

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牛源金黄色葡萄球菌esxb表达及免疫生物学特性分析

牛源金黄色葡萄球菌EsxB表达及免疫生物学特性分析

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作者：易鸳鸯新疆农业大学

学位级别：硕士

奶牛乳房炎是奶牛养殖业中发病率最高的疾病之一,该病防治困难,可对养牛业造成巨大经济损失,严重威胁人类健康。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)是引起该病的重要病原菌,该菌分泌多种致病因子,易产生耐药性且具有免疫逃避特... 详细信息

奶牛乳房炎是奶牛养殖业中发病率最高的疾病之一,该病防治困难,可对养牛业造成巨大经济损失,严重威胁人类健康。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)是引起该病的重要病原菌,该菌分泌多种致病因子,易产生耐药性且具有免疫逃避特性,防治极为困难。esxb作为***外分泌蛋白,在该菌的感染过程中可发挥重要作用,参与毒素的分泌及脓肿的形成。目前有关esxb功能研究较少,本研究旨在近一步阐明该蛋白的免疫生物学特性。本研究扩增esxb基因并构建原核重组表达质粒,诱导及表达esxb蛋白。将纯化后的蛋白免疫小鼠,比较分析该蛋白的免疫特性。为进一步评估比较esxb的免疫效果,本研究将该蛋白与本室前期构建与表达的5种蛋白Esx A、Ef B、Clf A、Fli C、Flj B分组免疫小鼠,运用ELISA方法检测免疫小鼠血清中特异性抗体水平、抗体亚型。SDS-PAGE电泳及Western-blot检测结果表明,获得了可高效表达的可溶性esxb重组蛋白,大小为17.6 k Da。esxb免疫小鼠后抗体效价可达1:729000,与对照组相比差异显著(Pesxb+Esx A,esxb+Esx A+Clf A免疫组抗体水平明显高于esxb+Flj B及esxb+Fli C免疫组(Pesxb免疫组小鼠组织荷菌量明显低于Fli C、Flj B、Ef B免疫组,esxb+Esx A+Clf A免疫组荷菌量最低(Pesxb联合免疫小鼠后对这些病变减轻且显著改善。攻毒后存活率结果显示,esxb+Esx A+Clf A联合免疫组存活率达到100%,esxb重组蛋白对小鼠的存活率达75%,高于Ef B免疫组(62.5%);Esx A+esxb联合免疫组的存活率(100%),高于Esx A免疫组(87.5%)和esxb免疫组(75%)。该结果表明,Esx A+esxb和Esx A+esxb+Clf A联合免疫可更好的保护小鼠抵抗***的攻击。利用流式细胞检测免疫细胞亚型并用荧光定量PCR免疫组免疫相关分子含量进行检测。荧光定量PCR结果显示,各免疫组小鼠,TLR2、TLR3、TLR4、MHC-Ⅰ、RP105、TCR与IL-10表达水平均有升高,联合免疫组TLR2、TLR3、TLR4表达量均明显高于单独免疫组(Pesxb免疫组各免疫相关分子的表达水平都较低;esxb+Esx A+Fli C免疫组TLR2、TLR3、TLR4、MHC-Ⅰ、RP105、TCR表达水平均高于其他免疫组;esxb+Esx A+Clf A免疫组IL-10表达量最多(Pesxb+Esx A及Esx A免疫组CD4T、CD8T、CD69T细胞表达水平高于esxb免疫组且esxb+Esx A联合免疫组T细胞表达水平最高。该结果表明,esxb+Esx A联合免疫后能够刺激小鼠产生更强的T细胞免疫应答,达到清除***的目的。该研究结果为esxb作为亚单位疫苗防治奶牛乳房炎奠定了实验基础。

关键词：金黄色葡萄球菌 esxb 原核表达免疫特性比较分析

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鞭毛蛋白FliC对牛源金黄色葡萄球菌esxb的免疫增强作用

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新疆农业大学学报 2020年第2期43卷 101-107页

作者：李胜男张雨薇古丽米热·对山巴依张雪静易鸳鸯王汉青苏艳新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

为分析马流产沙门氏菌鞭毛蛋白FliC对牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)esxb免疫增强作用,用表达纯化的FliC与esxb单独及联合免疫昆明小鼠,并以***分离株GW20-2攻击,检测免疫小鼠的抗体水平、攻毒保护力、体重变化、主要内脏... 详细信息

为分析马流产沙门氏菌鞭毛蛋白FliC对牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)esxb免疫增强作用,用表达纯化的FliC与esxb单独及联合免疫昆明小鼠,并以***分离株GW20-2攻击,检测免疫小鼠的抗体水平、攻毒保护力、体重变化、主要内脏器官荷菌数,观察肝、脾、肺及肾组织的病理组织学变化,通过real-time荧光定量PCR对免疫鼠脾细胞TLR2、TLR3、TLR4、MHC-Ⅰ、TCR的表达水平进行检测。结果表明,FliC与esxb联合免疫后对小鼠攻击保护率可达87.5%,降低肝、脾、肺及肾组织荷菌量,且FliC与esxb联合免疫组的TLR2、TLR3、TLR4、MHC-Ⅰ、TCR表达水平高于esxb单独免疫组。FliC可显著增强esxb的免疫保护效果。

关键词：金黄色葡萄球菌 FliC esxb 免疫增强

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结核分枝杆菌esxb-ESXA融合蛋白的表达及其作为检测抗原的初步应用

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生物技术通讯 2010年第4期21卷 501-504页

作者：赵海朱虹宋立华何君檀华端青病原微生物生物安全国家重点实验室军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

目的:探索一种大量表达结核分枝杆菌esxb-ESXA融合蛋白的方法,分析其抗原性,评价其在结核抗体检测中的初步应用。方法:采用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中分别扩增esxb和esxA基因,用Linker(G4S)3连接2条目的片段,连接pET-32a(+)载体,构... 详细信息

目的:探索一种大量表达结核分枝杆菌esxb-ESXA融合蛋白的方法,分析其抗原性,评价其在结核抗体检测中的初步应用。方法:采用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中分别扩增esxb和esxA基因,用Linker(G4S)3连接2条目的片段,连接pET-32a(+)载体,构建esxb-ESXA融合蛋白表达载体;重组表达载体转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达、纯化,Western印迹分析重组蛋白的抗原性;建立以融合重组蛋白为抗原的ELISA和胶体金检测方法,分析其在结核病抗体检测中的应用。结果:构建了esxb-ESXA融合蛋白的表达载体,重组esxb-ESXA在大肠杆菌中得以高效表达,表达量占菌体总蛋白的70%以上;Western印迹分析表明该重组蛋白具有较好的抗原性;ELISA和胶体金检测结果显示,用重组esxb-ESXA抗原检测临床结核病患者有较好的特异性。结论:重组esxb-ESXA融合蛋白表达量高并具有较好的抗原性,可作为结核病抗体检测的备选抗原。

关键词：结核病结核分枝杆菌 esxb ESXA 融合表达

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社区获得性金葡菌Ess分泌系统分泌蛋白esxb调控细胞凋亡促进细菌毒力的机制

社区获得性金葡菌Ess分泌系统分泌蛋白EsxB调控细胞凋亡促进细菌...

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第一届中国临床分子诊断大会

作者：吕慧颖戴颖欣王亚楠李敏上海交通大学医学院附属仁济医院

目的:研究金黄色葡萄球菌ESS系统分泌蛋白esxb在社区获得性金葡克隆株ST398中的功能及其在巨噬细胞中对细胞凋亡的影响。并筛选鉴定出esxb与宿主细胞直接相互作用的宿主蛋白,揭示金葡菌esxb蛋白在侵染宿主细胞过程中发挥作用的机制。方... 详细信息

目的:研究金黄色葡萄球菌ESS系统分泌蛋白esxb在社区获得性金葡克隆株ST398中的功能及其在巨噬细胞中对细胞凋亡的影响。并筛选鉴定出esxb与宿主细胞直接相互作用的宿主蛋白,揭示金葡菌esxb蛋白在侵染宿主细胞过程中发挥作用的机制。方法:取一株具有代表性的临床分离株作为野生株,构建esxb基因的突变株,并用质粒pOS1构建回补株。通过裸鼠皮肤脓肿模型、小鼠菌血症模型等研究该基因对金葡毒力和致病性的作用。构建毒力蛋白表达载体获得携带His标签的esxb蛋白,PMA诱导THP-1细胞系,获得人类巨噬细胞。通过流式细胞仪FITC-AnnexinV/PI双染法及western blot法,确定esxb蛋白对宿主细胞凋亡的影响。对细胞系THP-1进行SILAC标记后,加入带有His标签的毒力蛋白,共同孵育后用特异性亲和吸附His的树脂对发生相互作用的宿主细胞蛋白进行富集,进行蛋白电泳,找出与对照的差异条带,割胶进行质谱分析,确定与毒力蛋白相互作用的宿主细胞蛋白。结果:CA-SA克隆株ST398 ESS系统分泌蛋白esxb促进金黄色葡萄球菌的毒力,esxb突变株对小鼠生存、感染及皮肤脓肿形成能力均下降。esxb蛋白能够促进PMA诱导的巨噬细胞的凋亡。通过质谱分析,内质网应激相关的葡萄糖调节蛋白GRP78能与esxb毒力蛋白发生相互作用。结论:在社区获得性金葡菌侵染宿主的过程中,毒力蛋白esxb通过促进巨噬细胞凋亡来发挥毒力。esxb能够与GRP78蛋白相互作用。esxb可能通过这种相互作用影响宿主细胞的内质网应激,促进宿主细胞的凋亡,提升社区获得性金黄色葡萄球菌的毒力。

关键词：金黄色葡萄球菌毒力 esxb 凋亡

来源： cnki会议评论

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融合蛋白ABF对金葡菌感染版纳微型猪近交系皮肤创伤的修复作用

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中国农学通报 2015年第35期31卷 27-33页

作者：潘伟荣李俊虹肖晶刘海京刘欢曾养志查星琴张兴举云南省版纳微型猪近交系重点实验室昆明650201 云南省第一人民医院/昆明理工大学附属医院检验科昆明650032 深圳华大基因研究院广东深圳518083 深圳华大方舟生物技术有限公司广东深圳518083

随着金葡菌对畜牧业破坏性增加和耐药性增强,人们对研发靶向金葡菌的有效保护性疫苗日趋迫切。为开发出更具免疫保护效力的抗菌疫苗,本研究首次利用Esx A、Esx B联合细菌鞭毛蛋白Flic,即制备出融合蛋白ABF,并在版纳微型猪近交系皮肤创... 详细信息

随着金葡菌对畜牧业破坏性增加和耐药性增强,人们对研发靶向金葡菌的有效保护性疫苗日趋迫切。为开发出更具免疫保护效力的抗菌疫苗,本研究首次利用Esx A、Esx B联合细菌鞭毛蛋白Flic,即制备出融合蛋白ABF,并在版纳微型猪近交系皮肤创伤模型上做实验验证。实验用版纳微型猪分为4组:对照组、模型组、实验组Ⅰ和实验组Ⅱ。结果发现单独使用Esx B蛋白与对照组微型猪的免疫指标之间差距并不显著,而预先经融合蛋白ABF免疫的微型猪,检测到其外周血免疫因子Ig G总量表达显著上升,即机体体液免疫水平提高,同时融合蛋白ABF可以激活T细胞。此外其脾脏淋巴细胞CD8a、CD3e和IFN-γ阳性率均显著增高,皮肤创伤修复速度加快。总之,本实验研究成果证实融合蛋白ABF可作为潜在有效的金葡菌亚单位疫苗,为防治金葡菌提供新的研究途径。

关键词：金葡菌疫苗 EsxA esxb Flic

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