检索结果-南通市图书馆

中国生物化学与分子生物学报 2021年第4期37卷 487-494页

作者：文阳宣周桂旭石亚伟山西大学生物技术研究所教育部化学生物学与分子工程重点实验室太原030006

eglin c是来自水蛭中的一种小型热稳定蛋白质,属于马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂家族,可以抑制弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、组织蛋白酶、α-lytic蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等。然而,利用eglin c纯化蛋白酶,尚未见研究报道。本文将化学合成的... 详细信息

eglin c是来自水蛭中的一种小型热稳定蛋白质,属于马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂家族,可以抑制弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、组织蛋白酶、α-lytic蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等。然而,利用eglin c纯化蛋白酶,尚未见研究报道。本文将化学合成的编码eglin c及其突变体的基因序列,克隆到原核表达载体pQE30,在大肠杆菌BL21获得His6-Tag-eglin c及其突变体的重组蛋白质。SDS-PAGE显示,eglin c蛋白的分子量大约8 kD。His6-Tag-eglin c对胰凝乳蛋白酶、地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶的半抑制剂浓度(Ic50)分别为0.20±0.15、0.24±0.19、3.33±0.47和52.46±0.38μmol/L。利用分子对接、基因突变以及荧光光谱等,分析eglin c及其突变体与2709蛋白酶的相互作用。结果显示,2709碱性蛋白酶对eglin c荧光淬灭属于静态淬灭,解离常数为2.60×10^(-7)mol/L,eglin c中的Asn50残基对eglin c和2709碱性蛋白酶的结合发挥重要作用。利用eglin c与蛋白酶的特异结合的特性,构建亲和纯化载体,用于纯化来源于地衣芽孢杆菌的2709碱性蛋白酶,相比常规的蛋白酶纯化,显著简化了操作步骤。

关键词： eglin c 碱性蛋白酶相互作用亲和纯化

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

碱性蛋白酶2709与eglin c相互作用分析

碱性蛋白酶2709与eglin C相互作用分析

引用

作者：文阳宣山西大学

学位级别：硕士

蛋白酶是将蛋白质分解为短肽、多肽和氨基酸的水解酶。蛋白酶已经在洗衣粉、肉嫩化、皮革软化处理、羽毛加工等多种工业过程中得到广泛应用。在工业上应用的蛋白酶主要是微生物源蛋白酶,如何提高酶活,和简化蛋白酶的纯化一直是本领域的... 详细信息

蛋白酶是将蛋白质分解为短肽、多肽和氨基酸的水解酶。蛋白酶已经在洗衣粉、肉嫩化、皮革软化处理、羽毛加工等多种工业过程中得到广泛应用。在工业上应用的蛋白酶主要是微生物源蛋白酶,如何提高酶活,和简化蛋白酶的纯化一直是本领域的研究重点。eglin c是来自水蛭中的一种小型热稳定蛋白质,属于马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂家族,可以抑制弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、组织蛋白酶、α-lytic蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶。首先构建p QE30-eglin c和缺失N端8个氨基酸残基的p QE30-Δ(1-8)eglin c重组载体,并转化到Escherichia coli BL21(DE3)中进行重组表达,经Ni-Sepharose4B Fast Flow亲和柱和Superdex-75凝胶柱纯化获得电泳纯的eglin c和Δ(1-8)eglin c蛋白质,15%SDS-PAGE显示目的蛋白质分子量大约为8 k Da。然后分析eglin c对不同蛋白酶的抑制活性,eglin c对胰凝乳蛋白酶、地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶半抑制剂浓度(Ic)分别为0.20±0.15、0.24±0.19、3.33±0.47、52.46±0.38μmol/L,eglin c和Δ(1-8)eglin c对胰蛋白酶都无抑制活性,而Δ(1-8)eglin c对2709碱性蛋白酶Ic值为0.30±0.43μmol/L,与eglin c相比其对2709碱性蛋白酶的抑制能力基本不变,说明eglin c的N端是否缺失与对蛋白酶的抑制特性可能无关,但从稳定性分析发现蛋白酶会水解其N端,这也是N端的不稳定造成的结果。利用ZDOcK服务器进行eglin c和碱性蛋白酶2709之间的分子对接,发现碱性蛋白酶2709的4个氨基酸残基(Asn219,Ser100,Gly62,Ser99)与eglin c的反应位点处结合环的3个氨基酸残基(Asp46,Arg48,Asn50)形成界面相互作用,为了检验分子对接模拟结果,利用定点突变的技术,将分子对接所预测的关键残基中的Arg48和Asn50均突变为Ala,揭示eglin c R48A、eglin c N50A突变体对碱性蛋白酶2709的抑制活性的Ic分别为8.97±0.33μmol/L、1.96±0.42μmol/L。利用荧光光谱分析,研究了eglin c及其突变体R48A和N50A与蛋白酶2709的相互作用,eglin c、eglin c R48A以及eglin c N50A与碱性蛋白酶2709的解离常数分别为2.60×10mol/L、2.70×10mol/L、5.98×10mol/L,通过比较eglin c野生型及突变体对碱性蛋白酶2709的半抑制活性以及解离常数,我们发现Arg48位点只负责对蛋白酶活性的抑制,而Asn50不仅与碱性蛋白酶2709结合,也参与对蛋白酶活性的抑制,但对蛋白结合的作用强于活性抑制。最后制备的Ni-sepharose4B-His-Tag-eglin c亲和柱和Ni-sepharose4B-His-Tag-Δ(1-8)eglin c亲和柱,来纯化来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶2709,结果发现制得的Ni-sepharose4B-His-Tag-Δ(1-8)eglin c亲和柱更稳定,对于蛋白酶的纯化效果也更优,相比常规的蛋白酶纯化,大大简化操作步骤。总之,我们重组表达eglin c蛋白,分析了eglin c与几种碱性蛋白酶的结合关系,发现其与碱性蛋白酶2709较强的结合能力,Asn50位点对eglin c结合碱性蛋白酶2709影响明显;据此构建的碱性蛋白酶的纯化系统,可一步实现碱性蛋白酶2709的分离纯化。

关键词：碱性蛋白酶亲和纯化 eglin c 蛋白质工程抑制剂

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

Rational redesign of inhibitors of furin/kexin processing proteases by electrostatic mutations

引用

Acta Pharmacologica Sinica 2004年第12期25卷 146-152页

作者： Xiao-hui cAI, Qing ZHANG, Da-fu DING2 Key Laboratory of Proteomics, Institute of Biochemistry and cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, chinese Academy of Sciences, Graduate School of the chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, china 中科院上海生命科学院 Key Laboratory of Proteomics CAS 上海 200031

AIM: To model the three-dimensional structure and investigatethe interaction mechanism ofthe proprotein convertase furin/kexin and their inhibitors (eglin c mutants). METHODS: The three-dimensional complex structures of furin/ kexin with its inhibitors, eglin c mutants, were generated by modeller program using the newly published X-ray crystallographical structures of mouse furin and yeast kexin as templates. The electrostatic interaction energy of each complex was calculated and the results were compared with the experimentally determined inhibition con- stants to find the correlation between them. RESULTS: High quality models of furin/kexin-eglin c mutants were obtained and used for calculation of the electrostatic interaction energies between the proteases and their inhibitors. The calculated electrostaticenergies of interaction showeda linear correlation to the experimental inhibition constants. cONcLUSION: The modeled structures give good explanations of the specificity of eglin c mutants to furin/ kexin. The electrostatic interactions play important roles in inhibitory activity of eglin c mutants to furin/kexin. The results presented here provided quantitative structural and functional information concerning the role of the charge- charge interactions in the binding of furin/kexin and their inhibitors.

关键词： furin kexin eglin c drug design electrostatic mutation

来源：

同方期刊数据库评论

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：