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外泌体内eccdna在结直肠肿瘤微环境的作用及临床应用探索研究

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外泌体内eccDNA在结直肠肿瘤微环境的作用及临床应用探索研究

作者：邱承华中科技大学

学位级别：硕士

目的:提高肿瘤患者早期诊断几率,探索外泌体中的eccdna在肿瘤发生发展中的作用并与临床肿瘤患者的诊断建立联系,研究并分析eccdna含量与患者的早诊与预后情况之间的联系。方法:首先,通过在本院胃肠肿瘤实验室进行基础研究,在综合分析各... 详细信息

目的:提高肿瘤患者早期诊断几率,探索外泌体中的eccdna在肿瘤发生发展中的作用并与临床肿瘤患者的诊断建立联系,研究并分析eccdna含量与患者的早诊与预后情况之间的联系。方法:首先,通过在本院胃肠肿瘤实验室进行基础研究,在综合分析各种结直肠肿瘤细胞系后选取SW48细胞系进行后续实验。通过文献阅读,选定了富集方案,选取无血清培养基在细胞生长达到最大密度后继续培养,收集上清后经过0.22μm直径滤器后在超速离心后进行外泌体验证,经过纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)、免疫印迹试验(Western Blot,WB)、透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)等方案验证后再提取DNA。提取的DNA再去除线粒体DNA、线性DNA,经过两步实验后送eccdna特异性测序。对测序后的eccdna基因信息进行生信分析,对比正常结肠上皮细胞细胞内DNA测序,综合结果后选取其中基因片段较长的片段进行PCR验证,然后对各种结直肠肿瘤细胞细进行普遍性验证,然后对外泌体及eccdna的含量变化进行分析确定eccdna通过外泌体穿梭于细胞间进行信息传递。构建CT26 Dnase1l3 KO及Lig3 KO稳定细胞系后进行验证,再用Balb/c白鼠进行CT26细胞系皮下瘤种植,然后用稳定KO的细胞系上清提取的外泌体进行尾静脉注射,最后再对皮下瘤进行流式分析及免疫组化分析,找到外泌体中的eccdna对肿瘤细胞发生发展的影响。在基础部分研究结束后再进行临床研究,临床标本收集本院自2022年6月至2023年3月中来院诊断为结直肠肿瘤的患者,所有患者均在手术后病理确诊为结直肠肿瘤。所需正常样本均取同时段自体检中心经检测无其他肿瘤及慢性疾病者。再对正常人以及肿瘤患者的血清分别进行PCR验证,根据结果选取其中的一群基因作为模型进行正常人与肿瘤患者之间的筛选鉴别。结果:通过Westernblot、NTA等方案检测后确认超速离心等外泌体富集方法较好地富集了外泌体,并确定eccdna在结直肠肿瘤细胞系中的外泌体中普遍存在,生物信息学分析发现其基因片段与正常细胞胞内DNA有较大区别,且eccdna是通过外泌体分泌出细胞从而与其他细胞进行细胞间信息交流,在肿瘤微环境中发挥其作用。通过基因群圈定,对比正常细胞及不同阶段的肿瘤患者血样的eccdna的区别,确定一组可以预估为肿瘤发生发展时期代表的基因片段,为肿瘤早期诊断做出新的探索。结论:eccdna在外泌体中普遍存在且对肿瘤发生发展有促进作用,并在肿瘤患者及正常人中有较大差异,可以作为新的肿瘤早诊鉴定方向并推广向其他系统肿瘤早期诊断治疗。

关键词： eccdna 外泌体结直肠肿瘤微环境肿瘤免疫

染色体外环形DNA研究进展及其在畜禽育种中的应用

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生物技术通报 2022年第1期38卷 247-257页

作者：曹修凯王珊葛玲张卫博孙伟扬州大学教育部农业与农产品安全国际联合研究实验室扬州225009 扬州大学动物科学与技术学院扬州225009

染色体外环形DNA(extrachromosomal circular DNA,eccdna)指来源于基因组DNA并游离于染色体之外的双链环状DNA分子,它在真核生物中普遍存在。eccdna在数目、序列长度和基因组来源上存在很大差异,其功能也不尽相同,包括端粒可变延长、rDN... 详细信息

染色体外环形DNA(extrachromosomal circular DNA,eccdna)指来源于基因组DNA并游离于染色体之外的双链环状DNA分子,它在真核生物中普遍存在。eccdna在数目、序列长度和基因组来源上存在很大差异,其功能也不尽相同,包括端粒可变延长、rDNA拷贝数维持、衰老、耐药性和肿瘤发生等,eccdna与畜禽表型相关性已有报道。本文综述了eccdna的分类、产生机制、功能研究和鉴定方法等,并就eccdna在动物育种中的应用进行阐述。

关键词： eccdna ecDNA 高通量测序分子标记动物育种

染色体外环状DNA在肺腺癌血浆中的分子学特征

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染色体外环状DNA在肺腺癌血浆中的分子学特征

作者：曾文创广州医科大学

学位级别：硕士

背景:肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症之一,其中又以肺腺癌病人占比居多。靶向治疗和免疫治疗在肺腺癌病人中的应用使病人生存率得到很大提升,但随之而来的药物耐受性、癌基因突变又对临床带来新的挑战。寻找影响肿瘤基因突变的机... 详细信息

背景:肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症之一,其中又以肺腺癌病人占比居多。靶向治疗和免疫治疗在肺腺癌病人中的应用使病人生存率得到很大提升,但随之而来的药物耐受性、癌基因突变又对临床带来新的挑战。寻找影响肿瘤基因突变的机制成为重中之重。染色体外环状DNA(Extrachromosomal circular DNA,eccdna)基于其特有的功能和结构,成为近年来的研究热点。其游离于染色体基因组之外而不被受到调控;环状结构令其更加稳定,不易被降解;自身片段中又能携带一定数量的基因,eccdna这些特点在肿瘤的形成和发展中起到重要的作用。因此,本研究基于高通量测序技术并结合生物信息学,从分子学水平对血浆中游离的eccdna结构做初步分析,探索其在肺腺癌当中的影响。方法:经伦理审查委员会审核并批准后,采集来自广州医科大学附属第一医院共计12例肺腺癌病人和6例健康人群血液,提取血浆中游离DNA;此外,提取肺腺癌细胞系H3122和H1975染色体基因组DNA。对所提取的DNA,利用核酸外切酶Ⅴ降解线性DNA的外切酶活性,酶切去除线性DNA,并通过q PCR方法验证去除效果。接着用Phi29 DNA聚合酶和随机引物对其环形扩增。基于华大公司MGISeq-2000RS测序方法,对提取的eccdna进行文库构建,并通过滚环扩增和双末端测序原理上机、测序。采用Circle-Map算法,寻找比对上参考基因组的Reads中的环状片段,并重新组装环状DNA片段。最后,利用UCSC、Repeat Masker等生物数据库,比对分析eccdna片段序列的分子学特征,并使用R Studio软件对结果做统计分析、作图。结果:(1)肺腺癌病人和健康人群的血浆中均检测出微量的短片段eccdna。(2)肺腺癌病人eccdna片段长度整体要比健康人群短(中位值分别为340bp和361bp),但分析片段长度3000bp以上eccdna在血浆总eccdna的占比发现,肺腺癌病人长片段eccdna的占比显著高于健康人群。(3)分析大于3000bp eccdna的基因组结构元件,肺腺癌病人长片段eccdna中5’-UTR和3’-UTR区域比例显著高于健康人群。进行基因组功能元件分析时,发现与健康人群相比,在肺腺癌病人长片段eccdna中可被H3K4Me1、H3K4Me3、H3K27Ac组蛋白修饰的功能调控元件显著富集。(4)肺腺癌病人eccdna片段中重复元件数量比健康人群高,且在LINE、LTR两类重复元件占比高于健康人群。结论:本研究分析发现肺腺癌血浆中的eccdna在长度、基因组元件、调控元件、重复元件均与健康人群存在差异。这些特征的差异将有助于对肺腺癌的分子机制和潜在临床价值的进一步理解和研究。

关键词： eccdna 肺腺癌调控元件高通量测序

真核生物染色体外环状DNA数据库（TeCD）的构建与应用

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真核生物染色体外环状DNA数据库（TeCD）的构建与应用

作者：郭璟山东大学

学位级别：硕士

染色体外环状 DNA(Extrachromosomal circular DNA,eccdna)是一种广泛存在于真核细胞中的DNA,它是从染色体上分离或者脱落并自成环状的分子。最近的一些报道显示,eccdna常在细胞癌变和细胞老化过程中被大量积累,并且以特定的形式影响着... 详细信息

染色体外环状 DNA(Extrachromosomal circular DNA,eccdna)是一种广泛存在于真核细胞中的DNA,它是从染色体上分离或者脱落并自成环状的分子。最近的一些报道显示,eccdna常在细胞癌变和细胞老化过程中被大量积累,并且以特定的形式影响着一些细胞的生理学行为,因此人们对eccdna越来越重视,它也逐渐成为现代生物学研究中重要的新课题。然而,因为在不同的细胞和组织中,eccdna的数量、组成、来源以及表达模式都存在着显著的差异,所以对其功能和强化机制的研究一直是个难题,许多关于eccdna的基本问题仍未得到解答。在强烈的研究需求背景下,目前还没有一个完善的真核生物eccdna整合资源来为研究者们提供帮助。针对这一问题,本文构建了真核生物eccdna数据库(The eccdna Collection Database,TeCD),并搭建了真核生物 eccdna 数据库的生物信息学研究平台(http://***:2022/)以整合有价值的数据,为后续eccdna的研究提供数据共享平台和分析工具。本文首先建立了一个数据库来收集eccdna,包括动物,植物和真菌。收集的eccdna以统一的格式进行处理,并根据其所属的物种和来源染色体进行分类。每个eccdna记录都包含序列长度、相应染色体上的开始和结束位点、碱基序列、基因组元件(如基因和转座子)以及各自测序实验中的其他注释信息。利用序列比对工具对所有eccdna进行两两比对,去除同源或者包含的序列,减少冗余,所有的更新数据都存储在MySQL中。其次在数据库完成的基础上对其进一步开发,使用Ubuntu操作系统,利用Django框架实现前后端的连接,完成对MySQL数据库管理系统中数据的存储、调取和管理。网站服务器使用Nginx和uWSGI进行搭建,网页模板使用UI框架、DataTables和jQuery用于建立用户友好的前端界面,HTML、CSS和JavaScript被选为前端设计的客户端语言。最终建立了 TeCD平台,提供了数据的在线浏览、检索、下载、序列比对等操作功能,实现了真核生物eccdna数据资源的存储、开发和共享。数据的浏览形式多样,包括动态分类图、翻页表格以及基于JBrowse基因组浏览器的可视化展示,所有数据的统计分析也显示在网站页面中。数据的快速检索方式多种,包括eccdna的物种检索、ID检索、来源染色体检索、样本类型检索以及所覆盖基因检索。检索结果内容包括eccdna的ID、来源染色体、在染色体上的起始位点和终止位点、序列长度、完整核酸序列、覆盖基因、源文献、测序方法、基因组元件,并设置与其他数据库的相关链接,来增强数据资源的互操作性和用户检索的便利性。数据的下载方式包括检索结果的选中下载和全部数据的多格式文件下载。基于局部比对的搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool,BLAST)也被添加到TeCD中,用于分析潜在的eccdna序列。最后为了协助用户充分的利用数据资源,体现TeCD在实际科研工作中的应用价值,本文以酿酒酵母和人类的eccdna数据为例,分别进行了序列比对分析和富集分析。利用TeCD中的BLAST工具量化评估了 DNA损伤剂Zeocin诱导的DNA链断裂水平及其对eccdna形成的影响;选用人类eccdna上的高频基因进行富集分析,验证了 eccdna在肿瘤发展中起到的关键作用,并推测其在细胞间连接、信号转导和细胞代谢过程中的影响。这些发现可能为研究人员未来进一步探索eccdna的生物学意义提供依据和方向。总体来说,本文的主要目的是构建一个真核生物的eccdna数据库,以搜集和整理获得的多项eccdna相关数据为基础,结合多种生信分析工具和网站建设技术,并搭建真核生物eccdna数据库的生信分析平台。在平台构建完成后使用部分数据进一步分析,拓展TeCD数据库结果的应用性,为后续用户使用数据库开展eccdna的相关研究提供基础和方向。

关键词： eccdna 数据库 TeCD BLAST