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萝卜硫素影响结直肠癌中eif4f翻译起始复合物的机制研究

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萝卜硫素影响结直肠癌中eIF4F翻译起始复合物的机制研究

作者：邢运安徽医科大学

学位级别：硕士

目的结直肠癌是结肠和直肠粘膜上皮和腺体发生的恶性肿瘤,发病率和死亡率均较高,累计肝转移超过15%,为很多国家带来了沉重的健康压力。目前,结直肠癌的主要治疗方法为手术治疗+放化疗,但是继续寻找新的治疗方法却从未停止过脚步。本课... 详细信息

目的结直肠癌是结肠和直肠粘膜上皮和腺体发生的恶性肿瘤,发病率和死亡率均较高,累计肝转移超过15%,为很多国家带来了沉重的健康压力。目前,结直肠癌的主要治疗方法为手术治疗+放化疗,但是继续寻找新的治疗方法却从未停止过脚步。本课题主要研究萝卜硫素对结直肠癌细胞系中eif4f翻译起始复合物的影响,深入研究相关机制,为萝卜硫素在结直肠癌的治疗提供理论依据。方法(1)收集安医大二附院2015-2017年度结直肠癌患者手术标本,共12例,制成组织芯片,免疫组织化学染色检测肿瘤组织与癌旁组织中4EBP1、P-4EBP1、eif4E、P-eif4E、eif4G的表达情况与光密度值的比较。(2)12只健康雄性裸鼠随机分为实验组(n=6)与对照组(n=6)。实验组与对照组均腋下注射培养好混匀的结直肠癌细胞(HT-29)0.1ml,自第3天开始,实验组每天腹腔注射溶解于DMSO的萝卜硫素(0.5mg·kg),对照组腹腔注射溶剂DMSO(0.5mg·kg),共注射14天。14天后处死裸鼠,取出皮下移植瘤,测量大小体积,-80℃冰箱中保存。(3)HE染色观察裸鼠皮下肿瘤的形态结构。(4)免疫组化检测皮下移植瘤组织中AKT、P-AKT、P-mTOR、4EBP1、P-4EBP1、eif4E、P-eif4E、eif4G蛋白的表达情况。(5)结直肠癌细胞系HT-29细胞的培养。(6)MTT法检测萝卜硫素对HT-29活性的影响。(7)Western blot法检测萝卜硫素对于HT-29细胞PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR、4EBP1、P-4EBP1、eif4E、P-eif4E、eif4G蛋白表达的影响。结果(1)人类结直肠癌芯片免疫组织化学染色显示肿瘤组织中4EBP1、P-4EBP1、eif4E、P-eif4E、eif4G均比癌旁组织高,且差异显著(p4)免疫组织化学染色显示萝卜硫素可以降低AKT、4EBP1、P-4EBP1、eif4E、P-eif4E、eif4G的表达,但P-AKT、P-mTOR的表达增高。(5)MTT结果发现,萝卜硫素处理48小时可以显著抑制HT-29细胞的活性,且效果呈剂量依赖。(6)萝卜硫素(15、30μmol·L)作用48h,降低了HT-29细胞中AKT、mTOR、4EBP1、P-4EBP1、eif4E、P-eif4E蛋白的表达,提高P-AKT、P-mTOR蛋白的表达,而对PI3K的表达无明显影响。结论eif4f翻译起始复合物在结直肠癌的发生发展中起重要作用。萝卜硫素可以通过PI3K/AKT/mTOR/4EBP1信号通路影响结直肠癌细胞中eif4f翻译起始复合物的上调影响其发展,具体机制与4EBP1的磷酸化有关。

关键词：结直肠癌萝卜硫素 eif4f复合物 HT-29 4EBP1 免疫组化

七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eif4f复合物缓解大鼠肝纤维化

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安徽医科大学学报 2021年第11期56卷 1733-1738页

作者：谢海深周大臣李扬崔笑熊奇如喻宗繁安徽医科大学第二附属医院肝胆胰外科合肥230601 太和县人民医院血管外科太和236600

目的探究七叶皂苷钠对肝纤维化的作用及机制。方法通过四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型,治疗组给予七叶皂苷钠处理,通过HE、Masson染色及免疫组织化学染色检测模型组与治疗组大鼠肝组织胶原增生及纤维化程度。在细胞试验中,通过MTT、克隆... 详细信息

目的探究七叶皂苷钠对肝纤维化的作用及机制。方法通过四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型,治疗组给予七叶皂苷钠处理,通过HE、Masson染色及免疫组织化学染色检测模型组与治疗组大鼠肝组织胶原增生及纤维化程度。在细胞试验中,通过MTT、克隆形成实验检测HSC-T6细胞的生长增殖活性,通过流式细胞术检测HSC-T6细胞凋亡,通过蛋白免疫印迹检测HSC-T6细胞内蛋白表达情况。结果七叶皂苷钠使大鼠肝脏胶原纤维生成减少,纤维化减轻。七叶皂苷钠使HSC-T6细胞生长增殖抑制,蛋白表达降低,细胞凋亡增加。七叶皂苷钠抑制HSC-T6细胞内PI3K/AKT/mTOR通路和eif4f复合物的形成。结论七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eif4f复合物的合成进而缓解大鼠肝纤维化的进展。

关键词： eif4f复合物七叶皂苷钠肝星状细胞肝纤维化

七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eif4f复合物进而缓解大鼠肝纤维化

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七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物进而缓解大鼠肝...

作者：谢海深安徽医科大学

学位级别：硕士

目的肝炎-肝硬化-肝癌的连续发展过程为肝癌发展的一般规律,被称为肝癌发展的三部曲。我国作为最大的发展中国家是肝炎感染大国,也是肝癌患者高发国家,当前全世界对于肝癌的治疗方法包括手术切除肿瘤病灶、经B超引导的射频或微波消融... 详细信息

目的肝炎-肝硬化-肝癌的连续发展过程为肝癌发展的一般规律,被称为肝癌发展的三部曲。我国作为最大的发展中国家是肝炎感染大国,也是肝癌患者高发国家,当前全世界对于肝癌的治疗方法包括手术切除肿瘤病灶、经B超引导的射频或微波消融术、放射治疗、化学药物治疗和肝脏活体器官移植等,但是治疗效果有限。肝硬化为肝癌发展的重要中间过程,早期干预阻断此过程可大大降低患者发展为肝癌的可能性。肝硬化的发展是一个漫长的连续过程,肝纤维化是肝硬化发展的早期可逆阶段。肝纤维化的主要特征为肝星状细胞激活转分化为肌成纤维细胞,分泌大量的包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、α-SMA和纤维连接蛋白等在内的细胞外基质组分,不断沉积在肝小叶间的汇管区。七叶皂苷钠是从传统中药娑罗子中提取的主要成分,已知的功效包括抗炎、消肿、扩张血管和改善微循环等,前期实验证明七叶皂苷钠对原发性肝癌具有明显抑制作用,本研究主要探究七叶皂苷钠对肝纤维化发展的影响作用及机制。方法本研究主要通过体外和体内实验验证七叶皂苷钠对于肝纤维化发展的影响作用。体内实验将雄性大鼠分为空白对照组、CCl诱导的模型组和在CCl诱导的基础上给予七叶皂苷钠处理的治疗组三组。对照组大鼠予以橄榄油腹腔注射处理,模型组和治疗组均通过腹腔注射四氯化碳液诱导实验大鼠肝脏进展为肝纤维化,此处理贯穿于整个8周实验过程。从实验的第3周开始,对治疗组给予适量七叶皂苷钠进行腹腔注射,对照组以及模型组给予腹腔注射等量的医用生理盐水。第8周末时开腹取大鼠肝脏组织,通过免疫组化、HE以及Masson染色检测对照组、模型组和治疗组三组大鼠肝脏纤维化发展程度以及组织中胶原蛋白的表达情况。在体外细胞试验中,通过MTT、克隆形成实验检测七叶皂苷钠处理的HSC-T6细胞的生长增殖活性,通过流式细胞学检测七叶皂苷钠处理的HSC-T6细胞凋亡程度,通过免疫蛋白印迹检测七叶皂苷钠对HSC-T6细胞内eif4f复合物以及PI3K/AKT/mTOR通路中各蛋白表达影响情况。结果 CCl诱导大鼠肝纤维化形成明显,HE、Masson及免疫组化染色结果显示,七叶皂苷钠处理使大鼠肝脏细胞外基质中的α-SMA,COL-I和COL-III含量较四氯化碳诱导肝纤维化的模型组明显下降。MTT检测结果显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞增殖活性显著降低;克隆形成实验显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞的细胞集落形成数明显减少;流式细胞学检测结果显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞凋亡数量增加,以早期凋亡数量增加最为明显;免疫蛋白印迹表明,七叶皂苷钠可下调HSC-T6细胞中α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ等胶原蛋白的表达。七叶皂苷钠处理的大鼠肝组织免疫组化染色和HSC-T6细胞免疫蛋白印迹结果均显示e If4G,e If4E蛋白的表达量降低。七叶皂苷钠可下调HSC-T6细胞中PI3K/AKT/mTOR/4EBP1信号通路中各蛋白质的表达水平,降低4EBP1磷酸化水平。结论七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eif4f复合物的合成进而缓解大鼠肝纤维化的进展。

关键词： eif4f复合物七叶皂苷钠肝星状细胞肝纤维化

真核细胞翻译起始复合物4f对HCC患者的预后价值

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安徽医科大学学报 2022年第11期57卷 1712-1717页

作者：钱仁哲周大臣陆子恒贺良潘树波张彬安徽医科大学第二附属医院普外科合肥230601

目的研究真核细胞翻译起始复合物4f(eif4f)与肝细胞肝癌(HCC)患者临床预后的相关性。方法通过对标本库中743例HCC患者的临床数据进行随访,筛选出94位具有随访信息的HCC组织标本,并收集临床资料。将其配对的组织标本制作为组织芯片,进行... 详细信息

目的研究真核细胞翻译起始复合物4f(eif4f)与肝细胞肝癌(HCC)患者临床预后的相关性。方法通过对标本库中743例HCC患者的临床数据进行随访,筛选出94位具有随访信息的HCC组织标本,并收集临床资料。将其配对的组织标本制作为组织芯片,进行免疫组化染色。使用Image J分析组织芯片染色的吸光度值,通过R4.0.5软件对实验数据和随访数据进行非参数检验分析、绘制KM生存曲线、Cox回归分析、Nomogram统计分析。结果4EBP1的磷酸化在HCC肿瘤组织中更多的是处于激活状态(P4EBP1磷酸化的激活与HCC患者的临床预后相关(P=0.038)。结论肿瘤组织中的4EBP1的磷酸化的激活预示着HCC患者更短的总体生存时间。

关键词： eif4f复合物肝细胞肝癌疾病预后蛋白质翻译 Nomogram模型

真核细胞翻译起始复合物4f对肝细胞肝癌患者的预后价值

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真核细胞翻译起始复合物4F对肝细胞肝癌患者的预后价值

作者：钱仁哲安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:原发性肝癌是人体内消化系统常见的恶性肿瘤之一,在原发性肝癌之中,又以肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）最为常见。但是由于HCC发病隐匿、早期诊断困难、患者手术后预后不良且极易发生复发转移,导致目前对于肝癌的治... 详细信息

目的:原发性肝癌是人体内消化系统常见的恶性肿瘤之一,在原发性肝癌之中,又以肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）最为常见。但是由于HCC发病隐匿、早期诊断困难、患者手术后预后不良且极易发生复发转移,导致目前对于肝癌的治疗效率和效果产生了极大的影响,目前而言,手术切除肿瘤是治疗HCC最有效的治疗手段,放射性药物及索拉非尼等靶向药物的治疗均可改善HCC患者的预后。虽然这些治疗方式在临床疗效方面取得了一些进展,但是HCC患者的预后还是差强人意。在前期的研究中发现,在HCC细胞系中突变真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1的T37/46磷酸化位点,HCC细胞的增殖被显著抑制,本课题组推测,其可能与HCC患者的临床预后相关。因此,本研究评估真核细胞翻译起始复合物4f（Eukaryotic cell translation initiation complex 4f,eif4f）与HCC患者临床指标及预后的相关性。方法:通过对本研究中心标本库中743位HCC患者的临床数据进行筛选,共筛选出86位具有完整随访信息的HCC患者,将其保存的组织标本制作为组织芯片（Tissue Microarray,TMA）,进行免疫组织化学染色,通过R4.0.5软件对实验数据和随访数据进行非参数检验分析,分析HCC患者的临床特征;使用Image J软件分析组织芯片免疫组化染色结果的吸光度值,分析eif4f复合物中的调控因子4EBP1,Phop（Thr37/46）-4EBP1,eif4E,Phop（Ser209）-eif4E,eif4G在HCC患者中的表达,对其蛋白表达量进行相关性分析;绘制生存曲线分析eif4f中Phop（Thr37/46）-4EBP1与HCC患者预后生存时间的关系;将HCC患者的肿瘤数目、肿瘤大小、肿瘤的分化程度、患者的AfP水平高低纳入多因素回归分析,建立Cox风险比例模型,最后在Cox风险比例模型的基础上构建Nomogram模型评估eif4f对HCC患者预后生存的价值。结果:制作出四套组织芯片TMA1-4,包含了86例具有随访信息的HCC患者的组织标本,其中男性患者77人,女性患者9人,中位随访时间为48个月;免疫组织化学染色结果显示4EBP1,Phop（Thr37/46）-4EBP1,eif4E,Phop（Ser209）-eif4E,eif4G在癌组织中的表达高于其在癌旁组织中的表达;生存曲线提示Phop（Thr37/46）-4EBP1未激活组的生存时间高于Phop（Thr37/46）-4EBP1激活组的生存时间,平均生存时间分别为62个月和40.7个月（P=0.038）;Cox风险比例模型提示肿瘤数目显著影响HCC患者生存（P=0.035）;Nomogram模型提示Phop（Thr37/46）-4EBP1显著影响HCC患者的生存。结论:肿瘤组织中的4EBP1（Thr37/46）磷酸化的激活预示着HCC患者更短的总体生存时间。

关键词： eif4f复合物肝细胞肝癌疾病预后蛋白质翻译 Nomogram模型

4EGI-1对人胶质瘤U251细胞体外生物学行为的影响

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4EGI-1对人胶质瘤U251细胞体外生物学行为的影响

作者：杨鑫第四军医大学

学位级别：硕士

胶质瘤起源于神经胶质细胞,是最为常见的原发颅内肿瘤。根据WHO对于中枢神经系统肿瘤的分类胶质瘤被分为I-IV级,其中III-IV级胶质瘤属于恶性,占所有胶质瘤的77.5%。研究表明,恶性胶质瘤的年发病增长率在1.2%左右。恶性胶质瘤主要引起颅... 详细信息

胶质瘤起源于神经胶质细胞,是最为常见的原发颅内肿瘤。根据WHO对于中枢神经系统肿瘤的分类胶质瘤被分为I-IV级,其中III-IV级胶质瘤属于恶性,占所有胶质瘤的77.5%。研究表明,恶性胶质瘤的年发病增长率在1.2%左右。恶性胶质瘤主要引起颅内压增高及神经功能障碍,严重威胁患者生命安全。针对恶性胶质瘤采取的主要治疗手段是以手术切除为主,根据病理检查结果结合放疗、化疗等措施的综合治疗。免疫治疗、基因治疗、分子靶向治疗等新的治疗方法也正在逐步被应用到恶性胶质瘤的治疗中。尽管影像、麻醉、定向、导航、监测、放化疗等技术设备以及药物的发展,恶性胶质瘤患者的预后仍不容乐观。数据显示,我国脑及CNS恶性肿瘤死亡率为2.91/10万,构成比为2.39%。因此,寻找有效的手段治疗恶性胶质瘤有着重要的临床价值,会带来良好的社会效益。真核生物中,翻译起始因子eifs在mRNA的转录、翻译、蛋白质生物合成过程中起到了关键性作用,其中eif4A、eif4E、eif4G共同组成eif4f复合物,启动含有5’帽式结构的mRNA翻译过程。研究表明,eif4f复合物能够调节多种与肿瘤密切相关的基因的异常表达,具体表现为促进增殖、抑制凋亡、诱发放化疗抵抗、加速瘤组织血管化等。eif4E结合蛋白4E-BPs的磷酸化水平是决定eif4f复合物能否组装成功的关键:低磷酸化的4E-BPs会结合eif4E,阻止了eif4G与eif4E结合,造成eif4f复合物组装困难;反之,高磷酸化的4E-BPs不结合eif4E,eif4G会更多的与eif4E结合组装成eif4f复合物,进而造成eif4f复合物增加。线粒体在细胞内代谢、氧化还原平衡和细胞死亡的调控方面发挥了重要的作用。此外,线粒体应激反应升高和肿瘤的侵袭以及手术愈后有密切关系。当线粒体应激反应超过了细胞所能承受的范围将会触发细胞毒性反应,从而抑制肿瘤细胞的演进。包括:线粒体膜肿胀和膜上孔道打开,导致如细胞色素C等促细胞凋亡因子的外泄以及ATP合成和供给的下降。通过诱导线粒体功能异常作为肿瘤治疗的目标在近年来取得了越来越多的关注。若干因子被证实能够通过影响线粒体的功能,从而抑制肿瘤细胞在体内和体外的生物学行为。4EGI-1是一种小分子化合物,能够模拟4E-BPs的功能,扰乱eif4G来源的肽链和eif4E结合,进而形成稳固的eif4E/4EGI-1复合物,阻断eif4f复合物的形成。研究指出在多种肿瘤细胞系中,4EGI-1抑制了帽式翻译进而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,这种以eif4f复合物为靶点基因治疗恶性肿瘤的小分子化合物具有潜在的应用前景。然而4EGI-1对肿瘤细胞的增殖和凋亡的作用以及相关机制还没有被证实。因此,我们通过帽式翻译抑制因子4EGI-1处理U251细胞,通过Western blot观察其对eif4f复合物的影响;通过TUNEL染色、流式细胞术观察U251细胞凋亡;通过MTS细胞活性测试检测细胞活力;通过Rh123染色检测线粒体MMP变化;通过DCfH荧光检测ROS的产生;通过LDH释放检测细胞毒性;通过克拉克型氧气电极检测细胞线粒体复合物-I的耗氧量和耗氧率;通过实时定量PCR检测线粒体DNA含量和DNA转录情况;通过荧光染色观察U251细胞镜下立体外形变化;通过Western blot观察与线粒体动态学相关蛋白表达的改变;通过si RNA和特异的抑制剂mdivi-1干扰线粒体分裂蛋白表达,观察U251细胞的生物学行为变化,证实了4EGI-1对U251细胞的作用以及与肿瘤细胞内线粒体功能的关系。我们的结论是:1.在胶质瘤U251细胞内,4EGI-1通过影响eif4G而非eif4E以及4E-BPs来抑制eif4f复合物的表达。2.在胶质瘤U251细胞内,4EGI-1通过诱导氧化应激反应抑制细胞增殖并且诱导细胞凋亡。3.在胶质瘤U251细胞内,4EGI-1可以降低线粒体呼吸活动但并不影响线粒体生物合成。4.在胶质瘤U251细胞内,4EGI-1影响线粒体动态平衡蛋白的表达从而发挥肿瘤抑制作用,其中线粒体分裂蛋白Drp-1发挥了重要作用。

关键词： 4EGI-1 人胶质瘤U251细胞 eif4f复合物线粒体功能障碍基因治疗