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eif3e缺陷影响小鼠生长发育以及骨骼肌线粒体功能

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eIF3e缺陷影响小鼠生长发育以及骨骼肌线粒体功能

作者：黄林璐厦门大学

学位级别：硕士

研究背景:eif3作为最大且最复杂的一种真核翻译起始因子（eif）,在经典的翻译起始以及疾病发生过程中发挥着重要的作用。eif3e作为eif3家族的一个重要成员,是调节蛋白质合成的重要重要因子,但是eif3e特异性的生理功能仍然未知。课题组... 详细信息

研究背景:eif3作为最大且最复杂的一种真核翻译起始因子（eif）,在经典的翻译起始以及疾病发生过程中发挥着重要的作用。eif3e作为eif3家族的一个重要成员,是调节蛋白质合成的重要重要因子,但是eif3e特异性的生理功能仍然未知。课题组先前对粟酒裂殖酵母细胞的研究表明,由eif3e及其二聚体伴侣eif3d组成的模块可以促进线粒体电子传递链成分的合成,而缺乏该模块会导致呼吸系统缺陷、内源性氧化应激和过早衰老,提示eif3e对维持线粒体功能和体内稳态具有重要的作用。骨骼肌细胞含有丰富的线粒体,因此eif3e的表达缺陷可能会对骨骼肌功能产生影响。我们在eif3e敲低的小鼠模型中研究了 eif3e表达缺陷对骨骼肌的影响,并探讨了涉及的潜在分子机制。方法:为了进一步探究eif3e对线粒体功能的影响以及eif3e在体内的生理作用,我们利用RNA干扰技术敲低了乳腺癌细胞中的eif3e,并构建了 eif3e基因特异性敲除的杂合小鼠模型,通过生化实验以及动物行为学实验从细胞水平和个体水平上分析eif3e对线粒体功能的影响。结果:我们发现敲低了 eif3e之后,细胞中的电子传递链组分含量减少,线粒体完整膜蛋白表达水平降低并且出现大量破损的线粒体。另一方面,eif3e纯合敲除的胚胎不能正常生长发育,在发育的早期阶段已经死亡。然而,与野生型小鼠相比,eif3e杂合敲除小鼠（eif3e+/-）的生长及生育能力没有发现明显改变,但其体重和组织中eif3e的mRNA水平均有所降低。值得注意的是,在我们所检查的动物组织器官中,骨骼肌受到eif3e敲除的影响最为显著。小鼠抓力和耐力测试表明与野生型小鼠相比,eif3e+/-小鼠骨骼肌的肌肉力量明显减弱;透射电镜结果显示eif3e+/-小鼠的骨骼肌中有大量破损的线粒体并且肌节结构被严重破坏;NADH-TR活性染色结果表明eif3e+/-小鼠的腓肠肌和股四头肌中的NADH活性更弱,Complex Ⅰ活性显著降低。结论:我们的研究表明eif3e是维持小鼠正常生长发育的必需基因,并且eif3e对于线粒体功能和肌肉健康至关重要。

关键词： eif3e 线粒体骨骼肌

eif3e/INT6基因治疗促进皮肤创面愈合的在体研究

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eIF3e/INT6基因治疗促进皮肤创面愈合的在体研究

作者：姜琳西北大学

学位级别：硕士

研究背景:基因Int6编码蛋白为真核翻译起始因子3复合物的一个亚基,即eif3e(eukaryotic initiation factor 3e,eif3e)[1],eif3e/INT6 在真核翻译起始和调控蛋白表达中发挥重要作用。有报道称该基因为小鼠乳腺癌病毒(mouse mammary tumor ... 详细信息

研究背景:基因Int6编码蛋白为真核翻译起始因子3复合物的一个亚基,即eif3e(eukaryotic initiation factor 3e,eif3e)[1],eif3e/INT6 在真核翻译起始和调控蛋白表达中发挥重要作用。有报道称该基因为小鼠乳腺癌病毒(mouse mammary tumor virus,MMTV)在小鼠乳腺肿瘤细胞中的整合位点,由于插入基因座位的差异,可产生长度各异的截短型突变体[2]。近期研究发现,INT6蛋白能够特异性结合缺氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α),并对其功能进行调节。HIF-2α是缺氧信号通路的关键因子之一,人HIF-2α定位于染色体2p21-p16,其功能主要包括与HIF-β结合形成异源二聚体转录因子,转位入核特异性结合其靶基因启动子中的缺氧反应元件(hypoxia-responsive element,HRe),诱导其靶基因的转录,其靶基因主要包括关键血管生成因子如血管内皮生长因子(vasclar endothelial growth factor,VeGF)、血管生成素-1(angiogenesis-1,Ang-1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)[3]等,进而介导功能性血管的形成。有研究报道使用iRNA沉默Int6基因能够促进HIF-2α的表达以及积累,从而介导功能性血管生成而促进创面愈合,然而截短型INT6蛋白是否具有同样的功能,尚无报道。研究目标:为了初步揭示INT6是否对创面愈合有影响作用,本研究使用小鼠皮肤全层缺损模型系统比较了野生型及四种截短型Int6基因治疗的效果,四种截短型Int6分别为：Int6-2(1-410bp),Int6-A(1-493bp),Int6-B(494-1378bp)和 Int6-C(1-999bp)。方法和结果:用RT-PCR和分子克隆技术分别以pSecX为载体构建野生型INT6和四种截短型INT6-2、INT6-A、INT6-B和INT6-C真核表达载体,通过双酶切及测序鉴定其正确性。使用Si02吸附法大量制备质粒,TritonX-114等温相法去除内毒素[4]。建立小鼠皮肤全层缺损模型,体内转染pSecX-INT6、pSecX-INT6-2、pSecX-INT6-A、pSecX-INT6-B和pSecX-INT6-C,评价各组基因治疗的效果。通过小鼠皮肤再上皮化和血管化程度分析基因治疗的效果。结果发现,对各治疗组与对照组之间创面再上皮化面积进行Dunnett-t(ecX-INT6-C治疗组与空白对照组和PluronicF-127 hydrogel对照组间差异显著(p=0.002,0.003),与pSecX对照组差异极显著(p=0.000)。pSecX-INT6-B治疗组与pSecX对照组差异显著(p=0.011)。在治疗7d后,pSecX-INT6-B和pSecX-INT6-C治疗组创面再上皮化完成,与空白对照组,pSecX对照组和Pluronic F-127 hydrogel对照组间差异显著(p=0.011、p=0.004、p=0.001和p=0.004、p=0.001、p=0.000),其中pSecX-INT6-C组与Pluronic F-127 hydrogel对照组之间差异极显著(p=0.000)。pSecX-INT6-A 组与 pSecX 和 Pluronic F-127 hydrogel对照组之间创面未愈率也存在显著差异(p=0.039,p=0.012)。实验结果提示,pSecX-INT6-B和pSecX-INT6-C基因治疗能够通过再上皮化显著促进皮肤组织创面愈合。另外,观察组织Masson染色结果,在5d和7d时,pSecX-INT6-B和pSecX-INT6-C治疗组的胶原纤维排列明显较三组对照组有序,且与新生上皮组织平行,提示pSecX-INT6-B和pSecX-INT6-C可能能够抑制胶原纤维的沉积,而预防增生性瘢痕形成。结论:本研究系统比较了野生型INT6以及其四个截短型变异体INT6-2、INT6-A、INT6-B和INT6-C基因治疗对小鼠全层皮肤缺损模型的治疗作用,得出以下结论:(1)pSecX-INT-6-B和pSecX-INT-6-C基因治疗能够通过促进再上皮化加速创面愈合。(2)pSecX-INT-6-B和pSecX-INT-6-C基因治疗可能在创面愈合过程中通过抑制胶原沉积预防增生应瘢痕形成。(3)pSecX-INT-6-B和pSecX-INT-6-C基因治疗对创面愈合过程中的血管化促进作用不明显。

关键词：皮肤创面愈合基因治疗 INT6 eif3e HIF-2α

eif3e缺失对小鼠肝脏的影响及其抑制剂筛选

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eIF3e缺失对小鼠肝脏的影响及其抑制剂筛选

作者：云芸厦门大学

学位级别：硕士

研究背景:eif3是结构最复杂的翻译起始因子,由13个亚基(eif3a-m)组装形成,参与了真核细胞翻译起始和延伸的多个关键步骤。eif3e作为eif3家族的重要成员,已被报道其表达水平在不同癌症中存在上调或下调。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)包括... 详细信息

研究背景:eif3是结构最复杂的翻译起始因子,由13个亚基(eif3a-m)组装形成,参与了真核细胞翻译起始和延伸的多个关键步骤。eif3e作为eif3家族的重要成员,已被报道其表达水平在不同癌症中存在上调或下调。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)包括脂肪堆积、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌。RNA测序数据显示,和正常人群相比,肝癌患者eif3e的mRNA水平明显增高。实验室前期免疫组化染色结果同样显示,与正常肝组织相比,eif3e在肝癌组织的胞核中表达升高,提示eif3e在肝癌的发生发展中发挥着重要作用。研究方法:构建肝脏特异性敲除eif3e基因的小鼠模型,探究eif3e缺失对肝脏的影响;建立并优化以蛋白质细胞水平热迁移实验为基础的高通量筛选模型,用以筛选eif3e抑制剂作为潜在的药用化合物。研究结果:成功获得肝脏中特异性敲除eif3e的杂合小鼠(eif3eflox/+Cre+),和对照(Negative Control,NC)相比,杂合敲除(Heterozygote,He)的雄鼠谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)升高,总蛋白(TP)水平显著降低,白蛋白(ALB)水平出现一定程度的降低;He雌鼠只有AST水平升高于NC小鼠,TP水平降低。12月龄He雄鼠有58.3%的比例出现体重增加、腹部和身体脂肪含量增高,肝脏,处于脂肪肝阶段但未发展至肝纤维化。He雄鼠呈现更多凋亡细胞和更高的细胞凋亡比例、整体能量消耗和脂肪利用率更低。肝细胞线粒体基质变深、出现固缩,提示肝脏线粒体缺陷。利用蛋白质细胞水平热迁移实验,我们筛选了 90种化合物单体,未发现可用于进一步研究的eif3e抑制剂。后续高通量筛选模型(HTS)通过计算细胞株荧光值的Z’值衡量变异度和分离度,但Z’值偏小不足以开展高通量研究。这两种方法对于未来小分子抑制剂的筛选有启发意义。结论:本论文的研究结果显示肝脏中eif3e的缺失会导致小鼠出现肝功能损伤、脂肪肝和肝细胞线粒体缺陷,有可能与NAFLD的发生发展相关,为eif3e在小鼠组织器官中的功能提供探索性数据。

关键词： eif3e NAFLD 小分子抑制剂高通量筛选

eif3e通过调控UBAP2L形成应激颗粒对肿瘤发生与发展的作用

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eIF3e通过调控UBAP2L形成应激颗粒对肿瘤发生与发展的作用

作者：张雨瑞厦门大学

学位级别：硕士

真核翻译起始因子3(eif3)是最大、最复杂的翻译起始因子。人类的eif3是由13个亚基(eif3a～eif3m)组成的分子量约为800 kDa的组装体,它在蛋白质翻译起始和延伸过程中都起着至关重要的作用。课题组前期Bio-ID质谱数据显示,eif3e与泛素相... 详细信息

真核翻译起始因子3(eif3)是最大、最复杂的翻译起始因子。人类的eif3是由13个亚基(eif3a～eif3m)组成的分子量约为800 kDa的组装体,它在蛋白质翻译起始和延伸过程中都起着至关重要的作用。课题组前期Bio-ID质谱数据显示,eif3e与泛素相关蛋白因子2(UBAP2L蛋白)有相互作用。于是,本文探究了 eif3e与UBAP2L的相互作用对肿瘤发生与发展的作用。首先,基于课题组前期对eif3e影响线粒体蛋白的翻译过程的研究,本文探究了 UBAP2L的敲降对线粒体相关蛋白的影响,我们发现eif3e与UBAP2L互作并非通过影响线粒体功能进而对肿瘤产生作用。其次,结合近年来文献报道UBAP2L是应激颗粒的成核剂,本研究对eif3e与UBAP2L互作在应激颗粒中的作用进行了探索。应激颗粒(Stress granules,SGs)是真核细胞受到外界刺激时由未翻译的mRNA及核糖体相关蛋白形成的无膜结构,对肿瘤的发展具有促进作用。通过免疫荧光等一系列实验,我们发现当乳腺癌细胞处于应激状态时,eif3e会定位在UBAP2L形成的应激颗粒中,同时eif3e的敲降会抑制不同应激条件下(如热应激、氧化还原、紫外照射及渗透压刺激等)UBAP2L形成的应激颗粒。为了探究这一结论的具体机制,我们引用了一种新的、具有更高生物素化效率和更低假阳性率的Bio-ID系统,即miniTurbo系统,来寻找与eif3e及UBAP2L共同结合的应激颗粒相关蛋白。通过对其两者的质谱数据筛选分析及文献调研,同时结合实验验证,最终证实YTHDF3作为应激颗粒相关蛋白,参与了 eif3e敲降抑制UBAP2L形成的应激颗粒的过程。另外,本文还探究了 eif3b、d、k等亚基对热应激条件下UBAP2L形成的应激颗粒的影响。最后,通过生物信息学分析、MTT及划痕等实验,本文探究了 UBAP2L敲降抑制了对肿瘤细胞增殖与迁移,简单验证了应激颗粒对肿瘤发展的促进作用。综上所述,本课题探究了 eif3e可以通过与UBAP2L互作促进应激颗粒的形成进而促进肿瘤的发生与发展,为eif3e在肿瘤发生与发展过程中的研究提供了新机制。

关键词： eif3e 应激颗粒 UBAP2L 肿瘤发生与发展

RNA m6A阅读蛋白eif3e在胃肠癌中的表达及其与预后相关性研究

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RNA m6A阅读蛋白EIF3E在胃肠癌中的表达及其与预后相关性研究

作者：国情贺中国医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在探讨胃癌和结直肠癌中RNA m6A阅读蛋白真核翻译起始因子3e(eukaryotic translation initiation factor 3 e,eif3e)的表达及预后特征。研究方法:本研究共收集了202例胃癌患者的胃癌组织、癌旁肠化组织及癌旁正常胃组织,... 详细信息

目的:本研究旨在探讨胃癌和结直肠癌中RNA m6A阅读蛋白真核翻译起始因子3e(eukaryotic translation initiation factor 3 e,eif3e)的表达及预后特征。研究方法:本研究共收集了202例胃癌患者的胃癌组织、癌旁肠化组织及癌旁正常胃组织,和88例结直肠癌患者的癌旁正常结直肠组织以及肠癌组织,以上组织标本均由拥有丰富工作经验的病理医师取材来保证取材的准确性。用免疫组化染色的方法检测了eif3e蛋白在胃癌、癌旁肠化生组织和癌旁正常胃组织以及结直肠癌和癌旁正常结直肠组织中的表达。我们采用Kaplan–Meier生存分析方法,确定了eif3e蛋白表达在随访的147例胃癌和85例结直肠癌患者中的预后作用,并采用了多因素Cox回归分析确定了eif3e蛋白在随访的胃癌患者和结直肠癌患者中的预后作用,然后利用eif3e蛋白表达量的高低水平,分别构建一个临床预后列线图,用来评估新发胃癌患者和结直肠癌患者的预后。我们还通过免疫相关分析和GSeA通路分析探讨了eif3e对胃癌和结直肠癌预后作用不同这一现象的可能原因。结果:eif3e蛋白在胃癌组织中的表达量最低,癌旁正常胃组织中的表达量最高,肠化生组织中表达量居于二者之间(Peif3e蛋白的表达与胃癌患者的9个临床风险因素密切相关,这9个临床风险因素分别为浸润深度、大体分型、TNM分期、肿瘤大小、分化程度、是否有脉管癌栓、生长方式、是否有淋巴结转移和是否有神经周围浸润。在结直肠癌中,eif3e蛋白表达与结直肠癌的7个风险因素密切相关,这7个风险因素分别为:生长方式、是否有淋巴结转移、分化程度、大体分型、浸润深度、TNM分期和是否有脉管癌栓。eif3e蛋白的表达量是一个良好的可以独立预测胃癌和结直肠癌患者预后的预测变量(Peif3e高表达组的胃癌患者预后更好,而eif3e高表达组的结直肠癌患者预后却较差。我们根据eif3e表达水平高低构建了一个临床预后模型,用来评估新发胃癌和结直肠癌患者的预后,该模型对胃癌和结直肠癌患者预后的预测作用较好。在胃癌中eif3e表达与巨噬细胞呈负相关,而在结直肠癌中呈正相关。eif3e在结直肠癌高表达组中主要富集在与B细胞受体(B cell receptor,BCR)有关的调节过程,还有与高亲和力Ige Fc受体(Fc epsilon receptor,FCeRI)相关的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)与核因子k B(Nuclear factor k B,NF-KB)调节通路。而在胃癌高表达组中,eif3e在与B细胞受体有关的调节过程和与FCeRI相关的MAPK与NF-KB调节通路中富集下调。结论:eif3e蛋白在胃癌组织中表达量最低,癌旁肠化生组织中表达量居中,癌旁正常胃组织中的表达量最高,但是在正常结直肠组织中的表达量要明显低于结直肠癌组织。eif3e在胃肠癌中的表达和预后作用不同可能与巨噬细胞和BCR-MAPK-NF-KB通路有关。说明eif3e有可能成为一个潜在的胃癌和结直肠癌患者预后的生物标志物。

关键词： eif3e 胃癌结直肠癌表达预后生物标志物列线图

酵母双杂交系统筛选与HCMV pUL23蛋白相互作用的蛋白质

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2009年第5期30卷 566-570页

作者：赵振岭李实骞姚火旺周天鸿李弘剑暨南大学生物工程学系广东广州510632

将UL23基因的ORF序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-UL23,用酵母双杂交技术筛选人胚肾cDNA文库中与人巨细胞病毒pUL23相互作用的宿主蛋白分子,再通过回复酵母双杂交再次确认两者之间的相互作用.结果表明:酵母双杂交,回复... 详细信息

将UL23基因的ORF序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-UL23,用酵母双杂交技术筛选人胚肾cDNA文库中与人巨细胞病毒pUL23相互作用的宿主蛋白分子,再通过回复酵母双杂交再次确认两者之间的相互作用.结果表明:酵母双杂交,回复酵母双杂交试验证明宿主蛋白分子eif3e(eukaryotic trans-lation initiation factor3,subunit e interacting protein)能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用.宿主蛋白分子eif3e能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用,这为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.

关键词： pUL23 人巨细胞病毒酵母双杂交蛋白质相互作用 eif3e

真核翻译起始因子3e通过5'-UTR调控线粒体功能

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真核翻译起始因子3e通过5'-UTR调控线粒体功能

作者：张思琼厦门大学

学位级别：硕士

研究背景:真核翻译起始因子3(eif3)作为最大且最复杂的真核翻译起始因子,在翻译的起始、延伸和终止以及肿瘤的发展中发挥着重要的作用,eif3e是其中重要一员。课题组前期研究表明,eif3e与eif3d组成一个模块,促进线粒体电子传递链成分的... 详细信息

研究背景:真核翻译起始因子3(eif3)作为最大且最复杂的真核翻译起始因子,在翻译的起始、延伸和终止以及肿瘤的发展中发挥着重要的作用,eif3e是其中重要一员。课题组前期研究表明,eif3e与eif3d组成一个模块,促进线粒体电子传递链成分的合成进而能够调节内源性氧化应激、线粒体呼吸以及细胞的过早衰老。本课题在eif3e杂合敲除的原代鼠胚胎成纤维细胞(MeFs)中研究了 eif3e缺陷对线粒体活性的影响,以及其影响线粒体功能的分子机制。方法:首先利用eif3e条件敲除小鼠从动物水平研究eif3e缺失对小鼠胚胎发育的影响,其次我们从eif3e条件性敲除小鼠获得eif3e缺失MeFs来分析eif3e缺陷对线粒体的影响。然后通过LC-MS/MS对eif3复合体结构进行分析。最后我们构建了体外翻译系统,从分子机制水平阐述eif3e如何调控线粒体功能。结果:相比野生型鼠胚胎,eif3e缺陷小鼠胚胎发育变缓。在原代eif3e+/-MeFs中eif3e的mRNA和蛋白水平均有所下降,细胞生长变缓,但是eif3e的缺失对线粒体没有显著影响。原代MeFs受到环境压力时,半量eif3e不足以维持线粒体的功能。体外翻译系统的研究结果表明eif3e能通过线粒体蛋白的5'-UTR来调控线粒体蛋白的翻译,且向体外翻译系统中加入内源性eif3能恢复线粒体蛋白的正常翻译。结论:eif3e在小鼠胚胎发育阶段发挥重要作用,是小鼠生长发育所必须的,并且eif3e通过线粒体蛋白的5'-UTR来调控线粒体的功能。

关键词： eif3e 5'-UTR 线粒体肿瘤 MeFs