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人源抗肝癌单链抗体SA3与增强型绿色荧光蛋白的融合表达及其体内靶向性研究(英文)

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中南大学学报（医学版） 2011年第10期36卷 979-986页

作者：黄建李跃辉郭锋杰童永清王甲甲胡锦跃李官成中南大学肿瘤研究所卫生部癌变原理重点实验室教育部癌变与侵袭原理重点实验室长沙410078

目的:探讨人源抗肝癌单链抗体SA3与增强型绿色荧光蛋白(egfp-SA3)的融合表达、纯化、复性及其体内靶向性。方法:将SA3,egfp基因,插入pET-25b(+),构建egfp-SA3/pET-25b(+)原核表达载体,测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导融合蛋白... 详细信息

目的:探讨人源抗肝癌单链抗体SA3与增强型绿色荧光蛋白(egfp-SA3)的融合表达、纯化、复性及其体内靶向性。方法:将SA3,egfp基因,插入pET-25b(+),构建egfp-SA3/pET-25b(+)原核表达载体,测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导融合蛋白egfp-SA3的表达,复性、纯化后经SDS-PAGE鉴定;egfp-SA3与HepG2细胞经体外孵育后在荧光显微镜下观察单链抗体SA3与肝癌细胞的结合作用;然后通过尾静脉将其注射入荷肝癌裸鼠体内观察egfp-SA3的体内靶向作用。结果:SA3,egfp基因分别插入载体pET-25b(+)后,重组表达载体egfp-SA3/pET-25b(+)分别行NcoI-XhoI和NcoI-EcoRI双酶切,结果发现在750 bp左右出现一条带,与egfp基因大小一致,在1.5 kb左右处出现一条带,与egfp和SA3两个基因片段的总大小一致,DNA测序结果证实融合表达载体egfp-SA3/pET-25b(+)构建成功;重组表达载体egfp-SA3/pET-25b(+)经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示融合蛋白egfp-SA3分子质量为58 kD,主要以包涵体的形式存在;纯化、复性后,免疫荧光检测结果显示SA3与HepG2细胞能特异性地靶向结合;注射了egfp-SA3的荷肝癌小鼠的肿瘤部位有绿色荧光发出,显示egfp-SA3具有良好的肿瘤特异性。结论:融合蛋白egfp-SA3与HepG2细胞有较强的结合能力,单链抗体SA3有望用于肝癌的分子诊断和靶向治疗。

关键词：肝癌 scFv egfp 融合蛋白靶向治疗原核表达

HBD-3基因的乳腺特异性表达载体的构建及真核表达

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生物工程学报 2009年第7期25卷 968-974页

作者：彭巍兰志刚马晶晶王保垒张涌西北农林科技大学动物医学院生物工程研究所杨凌712100

为了制备高效表达人β-防御素-3基因的转基因奶牛提供可靠的核移植供体细胞,本试验采用RT-PCR从人胎盘组织获得人β-防御素3cDNA,通过双酶切法将目的基因片段hBD插入到质粒pBCP之间,最后再通过双酶切法将目的片段BCD插入到真核表达载体p... 详细信息

为了制备高效表达人β-防御素-3基因的转基因奶牛提供可靠的核移植供体细胞,本试验采用RT-PCR从人胎盘组织获得人β-防御素3cDNA,通过双酶切法将目的基因片段hBD插入到质粒pBCP之间,最后再通过双酶切法将目的片段BCD插入到真核表达载体pegfp-C1中,最终构建乳腺特异性表达载体pEBCD。脂质体介导法转染奶牛胎儿成纤维细胞G418,抗性筛选3-4周后,经PCR、RT-PCR扩增检测和报告基因egfp表达检测,得到稳定整合外源基因的转基因供体细胞;同时检测稳定转染的奶牛乳腺上皮细胞系的上清液,检测到重组人β-防御素-3蛋白可以在奶牛乳腺上皮细胞组织特异性表达。

关键词：人β-防御素 3 奶牛β-酪蛋白 egfp 报告基因供体细胞核移植

RNA干扰真核表达载体pegfp-H1介导的血管内皮生长因子shRNA治疗人胶质瘤的实验研究

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中华医学杂志 2005年第8期85卷 547-550页

作者：姜晓兵赵洪洋周凤刘如恩张方成赵甲山华中科技大学同济医学院附属协和医院神经外科武汉430022 深圳市眼科医院一病区中日友好医院神经外科

目的　构建针对血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(pegfpH1 /VEGF),观察其在体内和体外对胶质瘤细胞株U251生长的抑制作用。方法　应用PCR构建携带绿色荧光蛋白(egfp)基因的RNA干扰真核表达载体pegfp- H1,并利用该载体介... 详细信息

目的　构建针对血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(pegfpH1 /VEGF),观察其在体内和体外对胶质瘤细胞株U251生长的抑制作用。方法　应用PCR构建携带绿色荧光蛋白(egfp)基因的RNA干扰真核表达载体pegfp- H1,并利用该载体介导VEGFshRNA。用阳离子脂质体转染U251细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察egfp的表达,用RT- PCR检测VEGFmRNA的表达,以酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养液中VEGF蛋白的含量。同时筛选转染pegfp- H1和pegfp- H1 /VEGF的U251稳定细胞株,制备裸鼠U251细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况。结果　与空载体转染组相比, pegfp- H1 /VEGF对VEGF的抑制率达77. 9%。对照组和pegfp -H1组裸鼠肿瘤重量分别为1 .7g±0 4g和1 .5g±0 .7g,体积分别为1573mm3 ±330mm3 和1430mm3 ±382mm3,两组之间重量和体积差异均无统计学意义(P>0 .05 ),而pegfp- H1 /VEGF组肿瘤重量为0 .5g±0 .4g,体积为401mm3 ±272mm3,与对照组比较差异有统计学意义(Pegfp H1介导的VEGFshRNA能有效抑制U251细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长。

关键词： VEGF egfp 血管内皮生长因子肿瘤介导治疗真核表达载体 U251细胞 RNA干扰短发夹环RNA

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人工锌指核酸酶突变egfp基因的功能分析

生物工程学报 2013年第11期29卷 1573-1580页

作者：袁玉国于宝利宋绍征周峰张利清顾迎迎禹明慧成勇扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

锌指核酸酶技术在基因定点修饰中具有效率高和特异性好等特点,并成功应用于数十种生物。目前,该技术是否能应用羊上尚未报道。为了敲除转基因山羊标记基因(egfp),构建了一对针对egfp外显子上的锌指核酸酶表达载体,将其电转染至转egfp基... 详细信息

锌指核酸酶技术在基因定点修饰中具有效率高和特异性好等特点,并成功应用于数十种生物。目前,该技术是否能应用羊上尚未报道。为了敲除转基因山羊标记基因(egfp),构建了一对针对egfp外显子上的锌指核酸酶表达载体,将其电转染至转egfp基因胎儿成纤维细胞中,研究了锌指核酸酶突变egfp基因的效率和方式,利用基因显微注射单细胞获得获得的转基因(egfp)细胞系作为锌指核酸酶的靶细胞。结果显示,通过锌指核酸酶的突变作用,转染后的细胞发绿色荧光比例下降,测序结果显示在egfp外显子中插入1个碱基G,导致编码egfp基因的阅读框改变,从而起到基因突变的作用。结果表明,文中构建的锌指核酸酶对egfp基因有突变作用,可以为以后获得无标记基因供核细胞进行体细胞核移植生产克隆羊奠定基础。

关键词：人工锌指核酸酶核移植 egfp 基因打靶细胞显微注射山羊体细胞

egfp-Luc-Hepa1-6细胞系的构建及其在小鼠肝癌模型中的应用

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中国生物工程杂志 2015年第5期35卷 1-7页

作者：叶雨辰赵俊龙王琳段娟丽高春辰秦鸿雁窦科峰第四军医大学西京医院西安710032 第四军医大学基础部医学遗传学与发育生物学教研室肿瘤生物学国家重点实验室西安710032

目的:构建带有增强型绿色荧光蛋白egfp及荧光素酶luciferase的真核表达载体p CMVLuciferase-IRES2-egfp,对肝癌细胞系Hepa1-6转染后进行稳定筛选,并将表达该载体的细胞系应用于小鼠原位肝癌模型构建,以对小鼠肝癌细胞进行稳定标记与活... 详细信息

目的:构建带有增强型绿色荧光蛋白egfp及荧光素酶luciferase的真核表达载体p CMVLuciferase-IRES2-egfp,对肝癌细胞系Hepa1-6转染后进行稳定筛选,并将表达该载体的细胞系应用于小鼠原位肝癌模型构建,以对小鼠肝癌细胞进行稳定标记与活体示踪。方法:对p GL3-Basic质粒进行Xba I酶切、Klenow片段补平黏端、Xho I酶切获得luciferase小片段,与Xho I/Sma I酶切p IRES2-egfp质粒获得的载体大片段连接,获得重组质粒p CMV-Luciferase-IRES2-egfp。酶切鉴定、测序比对确认序列完全正确后,以重组载体转染Hepa1-6细胞进行稳定筛选,以荧光显微镜观察egfp表达,报告基因实验与LuminaⅡ成像系统检测荧光素酶活性。确认该细胞系中的质粒得到表达后,以该细胞系进行C57BL/6小鼠肝脏原位接种构建肝癌模型,以LuminaⅡ成像系统连续活体监测肝癌的生长,取离体的肝癌组织制备石蜡切片(HE染色)和冰冻切片(免疫荧光染色)分别观察离体肿瘤组织病理学特征及其中肝癌细胞绿色荧光蛋白表达情况。结果:成功构建表达p CMV-Luciferase-IRES2-egfp载体的Hepa1-6细胞系(egfp-Luc-Hepa1-6),并以该细胞系成功构建C57BL/6小鼠原位肝癌模型,实现小鼠肝癌细胞的活体示踪与体外标记。结论:成功构建egfp-Luc-Hepa1-6细胞系,且以此细胞系构建的小鼠原位肝癌模型可以同时实现小鼠肝癌生长的连续活体监测与离体组织检测。

关键词：肝癌 Hepa1-6 egfp Luciferase 小鼠载体

乙型肝炎病毒X基因转染人胆管癌细胞系及对端粒酶逆转录酶mRNA表达的影响

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中华外科杂志 2004年第20期42卷 1254-1257页

作者：屈振亮邹声泉王欣解放军第二五四医院普外科天津300142 华中科技大学同济医学院附属同济医院普外科

目的　了解乙型肝炎病毒X(HBx)基因转染对胆管癌细胞端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA的表达影响 ,阐明HBx基因调节hTERT基因转录表达在胆管癌发生中的意义。方法　体外培养胆管癌细胞QBC939,应用脂质体介导的基因转染技术 ,将含HBx基因的真... 详细信息

目的　了解乙型肝炎病毒X(HBx)基因转染对胆管癌细胞端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA的表达影响 ,阐明HBx基因调节hTERT基因转录表达在胆管癌发生中的意义。方法　体外培养胆管癌细胞QBC939,应用脂质体介导的基因转染技术 ,将含HBx基因的真核表达载体转染到胆管癌细胞中 ;转染 36h后以增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,egfp)表达判定转染成功率 ,流式细胞仪检测转染率 ;收集细胞提取总RNA ,逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)分析转染后细胞内hTERTmRNA的表达变化 ,并通过细胞免疫化学和WesternBlotting了解转染后胆管癌细胞内有无HBx蛋白的表达。结果　转染含HBx基因表达载体和空载体的QBC939转染率为 2 9 6 % ;转染HBx基因后hTERTmRNA表达量比未经转染或转染空载体的hTERTmRNA表达量明显增加 ;细胞免疫组化和WesternBlotting也证实只在转染了HBx基因的胆管癌细胞有HBx蛋白表达。

关键词：转染 HBx基因胆管癌细胞表达载体端粒酶逆转录酶 HBx蛋白人胆管癌 RNA egfp 增强型绿色荧光蛋白

腺病毒载体介导HBsAg基因在哺乳动物细胞中的表达

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中华实验和临床病毒学杂志 2005年第1期19卷 55-57页

作者：雷春亮黄呈辉杨湛唐小平广州市第八人民医院肝病科 510060 深圳市宝安区血站研究室

目的　探讨腺病毒载体介导乙型肝炎病毒 (HBV)前S2 S(preS2/S)基因在几种哺乳动物细胞中的表达。方法　制备携带HBVpreS2/S基因的非复制型重组腺病毒Ad-HBs ,体外转染人胚肾细胞 (2 93)、绿猴肾细胞 (Vero)、肝癌细胞系 (HepG2 )和间... 详细信息

目的　探讨腺病毒载体介导乙型肝炎病毒 (HBV)前S2 S(preS2/S)基因在几种哺乳动物细胞中的表达。方法　制备携带HBVpreS2/S基因的非复制型重组腺病毒Ad-HBs ,体外转染人胚肾细胞 (2 93)、绿猴肾细胞 (Vero)、肝癌细胞系 (HepG2 )和间质干细胞 (MSCs) ,荧光显微镜观察egfp的表达 ,同时采用RT-PCR检测目的基因的转录 ,ELISA法检测目的基因的表达。结果　MOI为 2 0的重组腺病毒Ad-HBs转染 2 93、Vero、HepG2 细胞和MSCs ,4 8h后 90 %以上的细胞表达egfp ,同时细胞表达高滴度的HBsAg(A值 >3 2 2 9)。结论　腺病毒载体不仅能够介导HBVpreS2 S基因于连续细胞系细胞中高效表达 ,也能介导HBVpreS2

关键词： HBV 介导腺病毒载体细胞表达 S基因重组腺病毒哺乳动物细胞高效表达 egfp 目的基因

载体法筛选乙型肝炎病毒S基因小干扰RNA靶位体系的建立

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中华肝脏病杂志 2004年第9期12卷 515-518页

作者：羊正纲陈智徐宁倪勤潘修成金晗英李敏伟浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所 310003

目的构建4个针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因序列的小发夹RNA(shRNA)表达载体,作用于增强型绿色荧光蛋白(egfp)和HBV S基因融合表达载体,观察shRNA对融合蛋白的抑制作用,筛选出有效靶位。方法利用pAVU6+27质粒,设计并构建4个shRNA表达载... 详细信息

目的构建4个针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因序列的小发夹RNA(shRNA)表达载体,作用于增强型绿色荧光蛋白(egfp)和HBV S基因融合表达载体,观察shRNA对融合蛋白的抑制作用,筛选出有效靶位。方法利用pAVU6+27质粒,设计并构建4个shRNA表达载体,与融合表达载体共转染AD293细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况并通过流式细胞仪分析shRNA对融合蛋白的抑制作用。同时,逆转录聚合酶链反应法验证其筛选的有效性。结果成功构建shRNA表达载体和HBs-egfp融合表达载体;4组shRNA表达载体均可不同程度抑制融合基因的表达,其中以579位点最有效,荧光表达抑制率为69.8％,RNA水平抑制率为74.6％。结论筛选出有效抑制HBV S基因的siRNA靶位。

关键词：小干扰RNA 靶位 HBV 乙型肝炎病毒S基因融合表达载体筛选抑制作用 egfp 融合蛋白增强型绿色荧光蛋白

pegfp-NTCP稳定转染HEK293细胞系的建立及鉴定

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中国药理学通报 2016年第12期32卷 1767-1772页

作者：陈雅李静张文政罗敏傅晓钟刘亭民族药与中药开发应用教育部工程研究中心贵州贵阳550004 贵州医科大学药学院贵州贵阳550004 国家苗药工程技术研究中心贵州贵阳550004 贵州省药物制剂重点实验室贵州贵阳550004

目的高效快速地建立稳定高表达钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的HEK293细胞系。方法构建可表达egfp-NTCP融合蛋白的p egfp-NTCP重组质粒,并利用Fu GENE 6转染试剂将重组质粒转染至HEK... 详细信息

目的高效快速地建立稳定高表达钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的HEK293细胞系。方法构建可表达egfp-NTCP融合蛋白的p egfp-NTCP重组质粒,并利用Fu GENE 6转染试剂将重组质粒转染至HEK293细胞中。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,挑选转染细胞进行14 d G418筛选和单克隆培养,以获得稳定转染细胞株。用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技术检测稳定转染细胞及正常细胞中NTCP mRNA和蛋白的表达情况,并进一步用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)考察稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力。结果使用本文优化的方法,细胞转染率可达90%。RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和牛磺酸摄取实验结果显示:相对于正常组,在荧光显微镜下呈绿色荧光的转染细胞;其NTCP表达均显阳性(P<0.01);且稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力明显升高(P<0.05)。结论高效快速地建立了稳定高表达NTCP的HEK293细胞系,为胆酸衍生物摄取机制研究奠定了基础。

关键词： NTCP egfp 稳定转染牛磺胆酸 HEK293细胞高效快速