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eef1a1基因克隆、原核分泌表达及融合蛋白纯化

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生物技术通报 2011年第6期27卷 127-133页

作者：郭艳荣常晓月崔晓君魏勋斌朱乃硕复旦大学生物医学研究院上海200032 复旦大学生命科学学院上海200434

eef1a1作为蛋白合成中的重要翻译延伸因子,可与多种功能性蛋白如F-actin、BPOZ-2结合,并在细胞凋亡、蛋白降解方面起重要作用。以往原核基因工程蛋白表达系统大多为包涵体表达的变性分子,需要复性。为了获得eef1a1原核分泌性可溶性蛋白... 详细信息

eef1a1作为蛋白合成中的重要翻译延伸因子,可与多种功能性蛋白如F-actin、BPOZ-2结合,并在细胞凋亡、蛋白降解方面起重要作用。以往原核基因工程蛋白表达系统大多为包涵体表达的变性分子,需要复性。为了获得eef1a1原核分泌性可溶性蛋白分子,克隆了人eef1a1蛋白编码序列(约1 300 bp),并成功构建pET22b-A原核分泌表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,0.4 mmol/L终浓度IPTG诱导,经不同温度下包涵体与胞浆蛋白组分分析,快速明确蛋白表达情况,即诱导4 h后,37℃表达于包涵体组分,在30℃分泌表达至胞浆组分。通过His-Trap亲和层析纯化柱进行线性洗脱,Bradford法测定蛋白浓度高达620 mg/mL,SDS-PAGE分析纯度约为95%,蛋白大小符合50 kD,Western blotting显示目的蛋白能被eef1a1抗体识别;质谱分析证实重组蛋白为人eef1a1蛋白分子。为进一步研究其与重要功能性蛋白的相互作用及在细胞凋亡和蛋白降解中的作用奠定基础。

关键词： eef1a1 基因克隆分泌表达融合蛋白蛋白纯化

eef1a1对光动力治疗中光敏剂PpIX在肿瘤细胞内富集的作用机制研究

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eEF1A1对光动力治疗中光敏剂PpIX在肿瘤细胞内富集的作用机制研究

作者：崔晓君复旦大学

学位级别：硕士

近十年来,5-ALA诱导的肿瘤光动力治疗获得了越来越多的关注,肿瘤中积累大量的PpIX是5-ALA诱导的PpIX应用于光动力治疗和诊断的基础。但是,在PDT中,光敏剂积累的机制目前并不十分明确,PDT的有效性和安全性主要依赖于光敏剂的肿瘤高选择... 详细信息

近十年来,5-ALA诱导的肿瘤光动力治疗获得了越来越多的关注,肿瘤中积累大量的PpIX是5-ALA诱导的PpIX应用于光动力治疗和诊断的基础。但是,在PDT中,光敏剂积累的机制目前并不十分明确,PDT的有效性和安全性主要依赖于光敏剂的肿瘤高选择性摄取,提高光敏剂的选择性积聚能力,可以大大提高光敏剂的治疗效果。本课题组之前以光敏剂PpIX为探针,通过亲和淘洗、分子印迹技术及荧光分析技术,从人肝cDNA噬菌体展示库中筛选到一种光敏剂结合蛋白,经过基因序列分析发现,该蛋白为人类翻译延伸因子eef1a1蛋白C末端25个氨基酸,并分别通过ELISA和Biacore的方法验证两者在体外确实存在结合作用。在本论文中,我们对光敏剂结合蛋白eef1a1在细胞内与光敏剂PpIX的亲和作用及eef1a1介导的细胞内PpIX富集作用进行了验证,并且初步探讨了eef1a1在光敏剂富集于肿瘤细胞中的作用机制。一、通过5-ALA培养HepG2,使细胞内富集PpIX,通过细胞免疫组化的方法,用FITC标记细胞内表达的eef1a1蛋白,使用共聚焦显微镜和尼康超分辨显微镜观察到两者在细胞内存在共定位,验证两者在细胞内的亲和作用。二、已经有研究表明,eef1a1在肿瘤细胞中的表达量高于正常细胞,因此,为了研究细胞中eef1a1对PpIX的积累是否有影响,我们检测ALA培养后,L02和HepG2细胞中PpIX的含量情况。之后,我们用实验室构建的可融合表达绿色荧光蛋白和eef1a1的pEGFP-C1-eef1a1重组质粒,转染HepG2细胞,观察到eef1a1高表达细胞中PpIX的富集量增加,进一步验证eef1a1作为肿瘤细胞富集PpIX的关键因子存在。三、为了进一步研究eef1a1影响细胞中PpIX变化的机制,我们向细胞裂解液中外源加入eef1a1和PpIX,通过M5酶标仪检测PpIX荧光强度的变化。发现,外源加入eef1a1后,PpIX荧光强度下降明显变慢,这些结果为eef1a1介导的PpIX提供了一种新的解释,eef1a1通过与PpIX结合,阻止了PpIX的降解或转化,从而造成了细胞中PpIX的积累。本研究首次明确光敏剂PpIX在肝癌细胞HepG2细胞中存在相互作用的蛋白eef1a1,为探讨PDT光敏剂PpIX选择性富集于肿瘤细胞的作用机制提供依据,为提高肿瘤光动力治疗效果奠定了基础。

关键词： eef1a1 光动力治疗光敏剂PpIX 肿瘤细胞

eef1a1介导鹿茸来源的MicroRNA PC-3p-2869调控骨肉瘤细胞增殖、迁移与侵袭

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eEF1A1介导鹿茸来源的MicroRNA PC-3p-2869调控骨肉瘤细胞增殖、...

作者：赵敏蝶东北林业大学

学位级别：硕士

为探索快速生长期马鹿（Cervus elaphus）鹿茸生长点软骨中新发现的低拷贝microRNAPC-3p-2869的生物学功能。本研究利用microRNAPC-3p-2869的预测靶标,参与肽链延伸、蛋白质翻译后修饰、细胞骨架调节、细胞周期、生长和死亡调控等,同时... 详细信息

为探索快速生长期马鹿（Cervus elaphus）鹿茸生长点软骨中新发现的低拷贝microRNAPC-3p-2869的生物学功能。本研究利用microRNAPC-3p-2869的预测靶标,参与肽链延伸、蛋白质翻译后修饰、细胞骨架调节、细胞周期、生长和死亡调控等,同时在真核细胞中高度保守的GTP结合蛋白eef1a1（真核翻译延伸因子1A1）进行验证。通过荧光素酶报告系统、定量逆转录PCR以及western blot实验研究microRNA PC-3p-2869对eef1a1的调控作用,同时采用细胞增殖、迁移和侵袭实验研究microRNA PC-3p-2869对细胞生理功能的影响。结果显示:（1）当microRNA PC-3p-2869 mimics与eef1a1 3’UTR野生型重组质粒共转染293T细胞系时,相较于其他实验组,本组的荧光素酶的表达量明显下降。（2）当 microRNA PC-3p-2869 mimics 和 NC mimics（negative control mimics,NC）分别转染MG63细胞系时,western blot实验检测microRNA PC-3p-2869 mimics处理组内源eef1a1蛋白表达量显著下降。（3）当 microRNAPC-3p-2869 mimics 和 NC mimics 分别转染 MG63 细胞系时,定量逆转录PCR结果表示microRNA PC-3p-2869 mimics处理组eef1a1 mRNA的表达量并未减少。（4）当 microRNAPC-3p-2869 mimics 和 NC mimics、si-eef1a1 和 si-NC 分别转染MG63和U2OS细胞系时,细胞增殖、迁移和侵袭实验检测microRNA PC-3p-2869 mimics或si-eef1a1处理组细胞的增殖、迁移和侵袭受到阻滞或抑制。研究表明:MicroRNA PC-3p-2869具有生物学功能;MicroRNAPC-3p-2869可以特异性靶向eef1a1 3’UTR,通过抑制mRNA翻译的方式负调控内源eef1a1基因的表达,从而阻滞或抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭;MicroRNA PC-3p-2869负调控eef1a1基因表达的机制具有进化保守性。

关键词： eef1a1 microRNA PC-3p-2869 细胞增殖细胞迁移细胞侵袭

eef1a1蛋白对肝癌细胞周期和增殖的影响及机制研究

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eEF1A1蛋白对肝癌细胞周期和增殖的影响及机制研究

作者：晏琛南昌大学

学位级别：硕士

目的:在Hep3B肝癌细胞中,利用短发卡RNA干扰技术沉默真核翻译延长因子1A1基因（eukaryotic translation elongation factor 1A1,eef1a1）的表达,探讨真核翻译延长因子1A1对肝癌Hep3B细胞增殖能力的影响及其可能的作用机制。方法:首先,... 详细信息

目的:在Hep3B肝癌细胞中,利用短发卡RNA干扰技术沉默真核翻译延长因子1A1基因（eukaryotic translation elongation factor 1A1,eef1a1）的表达,探讨真核翻译延长因子1A1对肝癌Hep3B细胞增殖能力的影响及其可能的作用机制。方法:首先,设计合成靶向的短发卡RNA（short hairpin RNA,shRNA）重组质粒,筛选稳定表达eef1a1-shRNA的Hep3B细胞株。然后,通过实时荧光定量-PCR和蛋白质印迹法分别验证eef1a1 m RNA和蛋白在肝癌Hep3B细胞中的表达情况。转染EF1A1-shRNA质粒后,分别检测细胞体外增殖能力、细胞克隆形成能力、细胞周期变化以及细胞周期相关蛋白如周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4,CDK4）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的蛋白表达。结果:（1）通过药物筛选,成功获得稳定低表达eef1a1的肝癌Hep3B细胞株;（2）eef1a1-shRNA质粒转染组与阴性对照质粒组相互比较,干扰组的细胞增殖能力和细胞克隆形成能力显著性的下降（P＜0.05）,并且干扰组中G1期细胞所占比例上升（P＜0.05）;（3）eef1a1-shRNA转染组Cyclin D1、CDK4蛋白的表达水平下调（P＜0.05）。结论:下调eef1a1蛋白表达可以显著性抑制肝癌Hep3B细胞的增殖能力、细胞克隆形成能力并使得肿瘤细胞周期停滞在G1期,表明在肝癌的增殖过程中,高表达的eef1a1蛋白可能起到调控的作用。

关键词：肝肿瘤细胞增殖 RNA干扰 eef1a1

eef1a1通过STAT1-cyclin D1轴影响肝癌细胞增殖的机制研究

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eEF1A1通过STAT1-cyclin D1轴影响肝癌细胞增殖的机制研究

作者：黄健南昌大学

学位级别：硕士

目的:真核细胞翻译延伸因子1A1(eukaryotic translation elongation factor 1A1,eef1a1)是一种进化上保守的延伸因子蛋白,它参与细胞的增殖,并在多种肿瘤细胞中高表达,另外,已有研究证实细胞周期与肿瘤细胞的增殖有关,而细胞周期蛋白cyc... 详细信息

目的:真核细胞翻译延伸因子1A1(eukaryotic translation elongation factor 1A1,eef1a1)是一种进化上保守的延伸因子蛋白,它参与细胞的增殖,并在多种肿瘤细胞中高表达,另外,已有研究证实细胞周期与肿瘤细胞的增殖有关,而细胞周期蛋白cyclin D1与细胞周期G1期密切相关,本文主要探讨eef1a1和cyclin D1两者之间的关系。方法:1、通过Western blot技术和RT-PCR技术检测eef1a1在HepG2、Huh7、HCCLM3、MHCC97H、Hep3B等肝癌细胞,以及永生化肝细胞HL-7702中的蛋白和mRNA表达情况;2、利用慢病毒构建稳定低表达eef1a1的肝癌细胞系,通过EDU实验和流式细胞实验,观察在稳定低表达eef1a1的肝癌细胞系中,肿瘤细胞的增殖情况和周期的变化;3、改变肝癌细胞中eef1a1的表达水平后,观察STAT1和cyclin D1的蛋白和mRNA变化情况;4、在稳定低表达eef1a1的肝癌细胞系中,分别过表达STAT1和cyclin D1,观察肝癌细胞的增殖情况。结果:1、通过蛋白质免疫印迹(Western blot)和实时荧光定量(RT-PCR)技术,发现eef1a1在肝癌细胞系中的表达量高于正常肝细胞;2、在稳定低表达eef1a1的HCCLM3肝癌细胞株中,细胞周期阻滞在G1期,肝癌细胞增殖能力下降;3、在HCCLM3肝癌细胞株中,下调eef1a1的表达水平,STAT1和cyclin D1的蛋白和mRNA水平也随之下降;4、eef1a1通过STAT1控制cyclin D1的表达来调控肝癌细胞周期的变化,进而影响细胞的增殖。结论:在肝癌细胞中,下调eef1a1的表达,STAT1和cyclin D1的表达也明显下降,细胞周期阻滞在G1期,肝癌细胞的增殖能力下降。但下调STAT1的表达并不影响eef1a1的变化,只降低了cyclin D1的表达水平。说明eef1a1可通过STAT1-cyclin D1轴控制肿瘤细胞的增殖。

关键词：肝细胞癌增殖 eef1a1 STAT1 Cyclin D1 细胞周期

eef1a1低表达对肝癌细胞凋亡、增殖与迁移的影响及eef1a1/A2与ANXA7间的相互作用

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eEF1A1低表达对肝癌细胞凋亡、增殖与迁移的影响及eEF1A1/A2与ANX...

作者：周淑亭大连医科大学

学位级别：硕士

背景:本组前期通过将小鼠肝癌腹水细胞注入小鼠足垫,经淋巴系统反复筛选,获得两株高度同源但淋巴道转移潜能差别显著的细胞株,Hca-F细胞株和Hca-P细胞株。Hca-F细胞株具有高转移潜能;Hca-P细胞株具有低转移潜能。我组先前研究发现,淋巴... 详细信息

背景:本组前期通过将小鼠肝癌腹水细胞注入小鼠足垫,经淋巴系统反复筛选,获得两株高度同源但淋巴道转移潜能差别显著的细胞株,Hca-F细胞株和Hca-P细胞株。Hca-F细胞株具有高转移潜能;Hca-P细胞株具有低转移潜能。我组先前研究发现,淋巴道高转移细胞中ANXA7在基因和蛋白水平的表达明显高于淋巴道低转移细胞,其表达水平与癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力呈正相关,提示ANXA7基因可能是参与肝癌淋巴道转移的关键基因之一。e EF1A1/A2是蛋白质翻译过程中的重要分子。近些年随着对其深入研究,发现e EF1A1/A2在多种恶性肿瘤中的异常高表达和癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力紧密相关。蛋白质是细胞功能的执行者,在细胞中常通过蛋白与蛋白之间的相互作用来调节各种生物学过程。因此,研究ANXA7与e EF1A1/A2之间的相关性,有利于进一步探讨它们在肿瘤增殖转移等方面的作用机制。目的:研究sh RNA抑制e EF1A1表达对肝癌Hca-P细胞凋亡、增殖、迁移的影响,并且通过分别下调e EF1A1和ANXA7的表达,检测其他相关基因在m RNA和蛋白水平表达量的变化,探讨Hca-P细胞中e EF1A1、e EF1A2与ANXA7表达的相关性及潜在的相互作用。方法:构建pGPU6/GFP/Neo-eef1a1-shRNA质粒表达载体和其阴性对照p GPU6/GFP/Neo-NC-sh RNA。将Hca-P细胞分为空白对照组(CON),转染p GPU6/GFP/Neo-e EF1A1-sh RNA的e EF1A1-sh RNA转染组(e EF1A1-sh RNA)和转染p GPU/GFP/Neo-NC的阴性对照组(NC)三组细胞。瞬时转染48h后荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白的表达量,应用CCK-8法、流式细胞仪和Transwell小室实验分别检测e EF1A1低表达对Hca-P细胞增殖、凋亡及迁移的影响。复苏本组先前建立并保存的ANXA7稳定下调的Hca-P细胞及其阴性对照组Hca-P细胞,实验中采用空白对照组(CON)、ANXA7-sh RNA稳定转染组(ANXA7-sh RNA)和阴性对照组(NC)三组Hca-P细胞进行对照。q RT-PCR和Western blot技术检测以上各组细胞中eef1a1、eef1A2及ANXA7基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果:e EF1A1靶向sh RNA成功下调小鼠肝癌Hca-P细胞中e EF1A1基因的表达。流式细胞仪检测显示,CON组、e EF1A1-sh RNA组、NC组细胞凋亡率分别为2.85±0.37%、4.71±0.21%、3.01±0.33%,e EF1A1-sh RNA组的细胞凋亡较CON组和NC组明显增加(P1A1-sh RNA转染细胞后细胞增殖能力较CON组和NC组明显下降;Transwell实验显示,CON组、e EF1A1-sh RNA组、NC组迁移细胞数目为123.75±9.26,66.84±17.47,115.31±12.59,对比CON组和NC组,e EF1A1-sh RNA组细胞迁移能力有显著减弱,差异有统计学意义(P1A1基因的表达后,肝癌细胞增殖及迁移能力显著降低,细胞凋亡显著增多。q RT-PCR和Western blot检测显示,e EF1A1-sh RNA转染组e EF1A2、ANXA7在m RNA和蛋白水平的表达量较CON组和NC组明显降低(P1A1与e EF1A2的比值(e EF1A1:e EF1A2)升高约1.8倍,ANXA7-sh RNA转染组e EF1A1、e EF1A2在m RNA和蛋白水平的表达量较CON组和NC组亦明显降低(P1A1的sh RNA使e EF1A1低表达,可诱导细胞凋亡,抑制细胞的增殖能力及迁移能力。e EF1A1、e EF1A2与ANXA7的表达密切相关,且e EF1A1与ANXA7存在相互作用,可能共同参与调控肿瘤的发生与发展。

关键词： eef1a1 eef1A2 ANXA7 凋亡细胞增殖细胞迁移

eef1a1在调控帕金森病神经炎症过程中的分子机制的初步探讨

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EEF1A1在调控帕金森病神经炎症过程中的分子机制的初步探讨

作者：早拉古丽·艾沙新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:真核细胞翻译延伸因子A1(Eukaryotic Elongation Factor 1A1,eef1a1)在神经退行性疾病中可能具有重要作用。此研究旨探讨EF1A1在帕金森病(parkinson`s disease,PD)神经炎症过程中的分子机制。方法:采用si RNA转染的方法,抑制eef1a1... 详细信息

目的:真核细胞翻译延伸因子A1(Eukaryotic Elongation Factor 1A1,eef1a1)在神经退行性疾病中可能具有重要作用。此研究旨探讨EF1A1在帕金森病(parkinson`s disease,PD)神经炎症过程中的分子机制。方法:采用si RNA转染的方法,抑制eef1a1在U251细胞中的表达。通过RNA-seq高通量测序技术寻找eef1a1敲低后产生的差异表达基因(Differential Expressed Genes,DEGs),并对其进行GO、KEGG富集分析,梳理DEGs参与的生物学过程和信号通路,筛选出与影响PD发生发展的神经炎症过程相关的基因,进一步行RT-q PCR验证,初步探讨eef1a1在PD神经炎症过程的分子机制。结果:RNA-seq分析发现,eef1a1敲低后,在转录水平上,显著上调U251细胞中的基因IL-6、GDF15、STC1、MT1E、GPNMB、CCL5、MT1X、A2M、VIP的表达。通过GO、KEGG富集分析发现,9个表达水平显著升高的基因富集到肿瘤坏死因子信号通路、体液免疫反应、炎症反应等多种与炎症相关的信号通路中。结论:eef1a1敲低后,显著上调的基因GDF15、STC1、MT1E、MT1X、GPNMB、VIP、A2M参与延缓PD的神经炎症过程,而基因IL-6、CCL5参与加重神经炎症的过程,提示eef1a1可能在转录水平上,通过调控与PD神经炎症过程相关基因的表达,参与PD的发生发展。

关键词： eef1a1 帕金森病神经炎症 RNA-seq

eef1a1通过调控ISG化影响肝癌细胞化疗敏感性

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eEF1A1通过调控ISG化影响肝癌细胞化疗敏感性

作者：戈进南昌大学

学位级别：硕士

目的:探讨真核翻译延长因子1A1基因(eukaryotic translation elongation factor 1A1,eef1a1)调控ISG化的水平变化,进而影响肝癌细胞化疗敏感性的机制。方法:通过实时荧光定量PCR技术以及Western blot技术检测肝癌细胞系中eef1a1 mRNA和... 详细信息

目的:探讨真核翻译延长因子1A1基因(eukaryotic translation elongation factor 1A1,eef1a1)调控ISG化的水平变化,进而影响肝癌细胞化疗敏感性的机制。方法:通过实时荧光定量PCR技术以及Western blot技术检测肝癌细胞系中eef1a1 mRNA和蛋白的表达水平,同时明确肝癌细胞系中ISG化水平情况。利用短发卡RNA干扰技术构建稳定低表达eef1a1的肝癌细胞系,在稳转细胞中加入阿霉素,分别检测细胞ISG化水平、细胞的增殖能力和细胞凋亡变化情况。在稳定低表达eef1a1的肝癌细胞系中恢复eef1a1的表达,再加入阿霉素,分别检测细胞ISG化水平、细胞的增殖能力和细胞凋亡变化情况。结果:(1)在肝癌细胞系中eef1a1高表达,ISG化水平较低;(2)加入阿霉素,稳定低表达eef1a1的MCC97H细胞与阴性对照组相互比较,低表达eef1a1组的细胞ISG化水平明显升高,细胞增殖能力显著下降(P1),并且凋亡细胞所占比例上升(Peef1a1,与阴性对照组相互比较,加入阿霉素,ISG化水平明显下降,细胞增殖能力显著上升(P1),并且凋亡细胞所占比例下降(Peef1a1的MCC97H细胞中恢复eef1a1的表达后,与未恢复eef1a1表达的细胞相互比较,加入阿霉素,ISG化水平明显下降,细胞增殖能力显著上升(P1),并且凋亡细胞所占比例下降(Peef1a1通过调控ISG化的水平变化,进而影响肝癌细胞在阿霉素治疗环境下的生物学特性。

关键词： eef1a1 ISG化原发性肝癌化疗敏感性

利用免疫共沉淀技术验证SET与eef1a1在人肝细胞内的相互作用

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安徽农业科学 2010年第35期38卷 19946-19948页

作者：杨亮杨细飞张毅刘建军李杰华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006 深圳市疾病预防控制中心毒理研究室广东深圳518020

[目的]探讨SET与eef1a1在人肝细胞内是否存在相互作用。[方法]以人L-02肝细胞为材料,在非变性条件下提取总蛋白,将鼠抗人SET、兔抗人eef1a1抗体分别加到总蛋白提取物中,用偶联了琼脂糖珠的Protein A/G分离抗原抗体复合物,最后分别用兔抗... 详细信息

[目的]探讨SET与eef1a1在人肝细胞内是否存在相互作用。[方法]以人L-02肝细胞为材料,在非变性条件下提取总蛋白,将鼠抗人SET、兔抗人eef1a1抗体分别加到总蛋白提取物中,用偶联了琼脂糖珠的Protein A/G分离抗原抗体复合物,最后分别用兔抗人eef1a1、鼠抗人SET抗体进行Western blotting检测。[结果]在用SET抗体免疫共沉淀下来的蛋白复合物中检测到eef1a1,同时在用eef1a1抗体免疫共沉淀下来的蛋白复合物中也检测到SET。[结论]SET与eef1a1在人肝细胞内存在相互作用。

关键词： SET eef1a1 免疫共沉淀相互作用