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植物保护学报 2023年第3期50卷 610-619页

作者：彭英传江婷朱玉麟张万娜张晶韩召军肖海军江西农业大学昆虫研究所南昌330045 南京农业大学植物保护学院农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室南京210095 北京林业大学草业与草原学院北京100083

为解析二化螟Chilo suppressalis体内参与降解双链RNA(double-stranded RNA,dsrna)的关键核酸酶的功能,克隆二化螟不同的非专一性核酸酶(non-specific nuclease,NUC)基因,并对这些基因进行生物信息学分析和组织定量表达分析,同时对dsRN... 详细信息

为解析二化螟Chilo suppressalis体内参与降解双链RNA(double-stranded RNA,dsrna)的关键核酸酶的功能,克隆二化螟不同的非专一性核酸酶(non-specific nuclease,NUC)基因,并对这些基因进行生物信息学分析和组织定量表达分析,同时对dsrna降解酶(dsrna degrading nuclease,dsrnase)活力的组织分布进行研究。结果显示,共克隆获得5个NUC基因,其中有4个编码dsrnase亚家族基因(Csdsrnase1~Csdsrnase4)和1个编码Endonuclease G亚家族基因(CsEndoG)。5个NUC基因的开放阅读框核苷酸序列长度范围为828~1338 bp,编码275~445个氨基酸残基,其分子量大小为31.68~49.57 kD,预测等电点为5.48~9.42。Csdsrnase1和Csdsrnase2含有信号肽序列,两者相似度极高,且与家蚕Bombyx mori和斜纹夜蛾Spodoptera litura中具有dsrna降解酶活力的dsrnase同源聚类;Csdsrnase1和Csdsrnase2均在二化螟中肠中高表达,这与中肠组织超高的dsrna降解酶活力分布模式一致,表明这2个基因可能是中肠参与降解dsrna的关键核酸基因。二化螟体内存在多条dsrnase基因序列,尤其是中肠中高表达的Csdsrnase1和Csdsrnase2可影响二化螟体内dsrna的稳定性,从而影响RNA干扰效率。

关键词：二化螟非专一性核酸酶基因克隆 RNA干扰 dsrna降解酶

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飞蝗双链RNA降解酶的抗体制备及组织定位

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中国农业科学 2018年第19期51卷 3704-3713页

作者：宋慧芳张建琴范云鹤李涛马恩波张建珍山西大学应用生物学研究所山西大学生命科学学院农业有害生物综合治理山西省重点实验室山西大学中医药现代研究中心

【目的】双链RNA降解酶(dsrna degrading enzyme, dsrnase)是制约RNA干扰(RNAi)技术在害虫防治中应用的关键因素之一。本研究旨在利用原核表达系统获得飞蝗Lmdsrnase2和Lmdsrnase3的特异抗原,进而制备抗体,对其进行组织定位和蛋白表达... 详细信息

【目的】双链RNA降解酶(dsrna degrading enzyme, dsrnase)是制约RNA干扰(RNAi)技术在害虫防治中应用的关键因素之一。本研究旨在利用原核表达系统获得飞蝗Lmdsrnase2和Lmdsrnase3的特异抗原,进而制备抗体,对其进行组织定位和蛋白表达量检测,为进一步解析飞蝗中肠dsrna降解酶基因的功能分化提供蛋白水平的证据。【方法】通过对Lmdsrnase2和Lmdsrnase3的氨基酸序列(GenBank:ARW74135.1和ARW74134.1)进行比对,分别选取特异的Lmdsrnase2和Lmdsrnase3抗原序列(R2’、R3’)进行后续的研究。根据Lmdsrnase2和Lmdsrnase3的cDNA全长序列,设计包含酶切位点BamH I、Hind Ⅲ的引物,采用PCR技术扩增目标片段,双酶切后连接至pET-32a载体。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,加入IPTG至终浓度为0.5mmol·L-1,37℃下诱导4 h后提取蛋白,采用SDS-PAGE电泳方法检测蛋白表达。大量培养带重组质粒的大肠杆菌,诱导目的蛋白大量表达,用镍柱亲和层析法分离R2’和R3’蛋白,Bradford法检测蛋白浓度。经两次免疫新西兰大白兔后,最终获得Lmdsrnase2和Lmdsrnase3的多克隆抗体。利用ELISA法测定多克隆抗体的效价,通过Western blot检测抗体的特异性。提取飞蝗5龄第3天的中肠组织蛋白和中肠液,分别用Lmdsrnase2和Lmdsrnase3的抗体检测其表达量。最后制备飞蝗5龄第3天的中肠石蜡切片,通过免疫组化对Lmdsrnase2和Lmdsrnase3蛋白进行亚细胞定位。【结果】通过氨基酸序列比对发现,Lmdsrnase2和Lmdsrnase3具有37%的序列一致度,选取特异的序列R2’和R3’设计引物,分别包含157和153个氨基酸残基,理论分子量分别为17.0和16.8 kD。在IPTG浓度为0.5 mmol·L-1条件下,37℃诱导4 h后,目的蛋白在包涵体中大量表达。扩大培养重组菌株后提取蛋白,用镍亲和层析柱分离得到纯度为85%的R2’蛋白,可直接用于免疫;而R3’蛋白的纯度低于85%,利用电泳切胶纯化后免疫新西兰大白兔,36 d后取抗血清进行检测,效价均达到1:102 400,表明抗体效果良好。用多克隆抗体杂交实验室保存的His-Lmdsrnase2和His-Lmdsrnase3融合蛋白,对抗体进行特异性检测,结果表明R2和R3的抗体分别特异性识别Lmdsrnase2和Lmdsrnase3,无交叉杂交现象,且条带与His抗体杂交到的条带大小一致。采用Western blot方法检测,发现Lmdsrnase2蛋白在中肠组织中高表达,但在中肠液中未检测到可见表达,Lmdsrnase3蛋白在中肠组织和中肠液中均未检测到表达。进一步采用免疫组化方法对两个蛋白进行组织定位,发现Lmdsrnase2和Lmdsrnase3均在中肠细胞质中表达,但Lmdsrnae3的表达量较低。【结论】成功制备了特异性良好的飞蝗Lmdsrnase2和Lmdsrnase3抗体,Western blot和免疫组化分析表明Lmdsrnase2在中肠细胞质中高表达,而Lmdsrnase3的表达量很低。研究结果为飞蝗中肠两个dsrna降解酶Lmdsrnase2和Lmdsrnase3的功能分化提供了蛋白水平的证据。

关键词：飞蝗 dsrna降解酶多克隆抗体组织定位

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