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基于RNAi的生物农药研究进展

浙江农业学报 2024年第4期36卷 968-977页

作者：路子琪王静张震王教瑜孙国仓林福呈浙江农林大学现代农学院浙江杭州311300 农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室农业农村部农业微生物组学重点实验室浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所浙江杭州310021

化学农药的大量使用产生的病虫害抗性、环境污染和农产品安全等一系列问题,使得新型可持续的植物保护策略成为农业绿色发展的必然要求。近年来,RNAi在植物病虫害防控中的应用潜力得到越来越多的关注,基于RNAi的生物农药(即核酸农药)的... 详细信息

化学农药的大量使用产生的病虫害抗性、环境污染和农产品安全等一系列问题,使得新型可持续的植物保护策略成为农业绿色发展的必然要求。近年来,RNAi在植物病虫害防控中的应用潜力得到越来越多的关注,基于RNAi的生物农药(即核酸农药)的研发越来越迅速。核酸农药以喷雾诱导基因沉默(SIGS)为基础,通过外源施用针对靶标病原菌或害虫的dsrna,即可触发RNAi从而抑制病原菌或害虫,实现对靶标病虫害特异性控制。由于核酸农药具靶标特异性、环境友好、不易产生抗性等优势,相关研究和开发进程日益加快,使之有望成为化学农药的重要补充或替代。文章对核酸农药的作用机制、研究进展、产品研发和应用现状,在商业化和使用过程中的风险以及需要注意的问题进行了综述,以期为相关研究提供参考。

关键词：核酸农药 RNAi dsrna 病虫害防控

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Inhibition of BmNPV replication in Bombyx mori cell by dsrna triggered RNA interference

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Chinese Science Bulletin 2004年第12期49卷 1261-1266页

作者： XUYing ZHUChenggang JINYongfeng ZHANGYaozhou BiochemistryandMolecularBiologyInstituteofZhejiangUniversity Hangzhou310029China ZhejiangUniversityofScience Hangzhou310018China

RNA interference (RNAi) causes degradation of targeted endogenous RNA in many diverse organisms. To investigate the effect of dsrna on silkworm cells, we trans- fected three kinds of synthetic dsrnas of 435 bp(Ap1), 300 bp(Ap2) and 399 bp(AH) in length against the various regions of BmNPV’s DNA polymerase gene and DNA helicase gene, which are indispensable for viral replication in silkworm cells by TransMessengerTM transfection Reagent. Results indicated that in the experiment where silkworm cells were infected with wild-strain BmNPV of the three dsrnas, Ap2 and AH can effectively suppress the replication of virus, but Ap1 had no effect on the inhibition of viral replication. Ap2 and AH can reduce the infective titer of BmNPV with a peak change of approximately 3—4 logs on day 4 post-infection. The results of reverse transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) and DNA dot blotting also indicated that the ex- pression level of the two target genes and the quantity of viral DNA both distinctly decreased under the influence of Ap2 or AH. Furthermore, using fluorescence microscopy we analyzed the distribution patterns of dsrna. Our studies revealed that a majority of dsrna was localized in the nu- clear periphery discontinuously after 24 h of transfection.

关键词： BmNPV复制 RNAi dsrna 抑制 RNA干涉蚕转染核型多角体病毒

外源dsrna介导的RNAi对烟草CMV侵染的抑制作用

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烟草科技 2023年第3期56卷 1-5页

作者：李锡宏罗朝鹏许汝冰刘俊霞黎妍妍杨军张剑锋湖北省烟草科学研究院武汉市430030 中国烟草总公司郑州烟草研究院郑州450001

为研究外源dsrna介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对烟草黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)侵染的抑制作用,选择与病毒在寄主体内胞间移动和长距离运输密切相关的移动蛋白(Movement protein,MP)基因为靶标,通过克隆CMV MP基... 详细信息

为研究外源dsrna介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对烟草黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)侵染的抑制作用,选择与病毒在寄主体内胞间移动和长距离运输密切相关的移动蛋白(Movement protein,MP)基因为靶标,通过克隆CMV MP基因,结合序列分析评估设计dsrna,以体外合成的方式制备了MP基因中一段490 bp的dsrna。通过与CMV共接种,结合MP基因表达水平和病毒发病症状,综合评价MP dsrna对CMV的抑制效果。结果表明,外源喷施的MP dsrna显著降低了染病烟株中CMV基因的表达水平,有效抑制了病毒的侵染和危害,具有烟草CMV生物防治的应用潜力。

关键词：烟草 CMV dsrna RNAi 生物防治

香蕉枯萎病菌myosin-1基因的功能分析及外施dsrna介导的抗性评估

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植物病理学报 2022年第3期52卷 321-333页

作者：曾凡云刘远征王艳玮漆艳香张欣谢艺贤彭军中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室海口571101 中国热带农业科学院海口实验站海口571101

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor ... 详细信息

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor domain,MMD),肌动蛋白尾结构TH1(myosin tail)和Src家族同源结构域SH3(src homology domain 3),与禾谷镰刀菌中氰烯菌酯靶标基因myosin-5具高度的蛋白同源性,相似性高达83%。利用Split-marker基因重组技术获得Foc4的myosin-1基因敲除突变体,Δmyosin-1突变株丧失了对氰烯菌酯的敏感性,菌丝生长缓慢,产孢量减少且孢子畸形,对香蕉致病力严重下降,证实myosin-1是氰烯菌酯在Foc4中的作用靶标基因。外施靶向myosin-1体外转录的dsrna,能抑制菌丝的生长,降低菌丝活性;菌丝膨胀扭曲分枝增多,出现典型的球状结构,与氰烯菌酯处理后的表型一致。在盆栽活体人工接种实验中,体外施用dsrna可以明显抑制枯萎病外部症状的发展,推迟发病时间,赋予寄主抗性,结果说明体外施用dsrna可以作为新型杀菌剂防治香蕉枯萎病。综上,myosin-1基因作为氰烯菌酯在Foc4中的靶标基因具有高度的序列保守,在调控菌丝生长发育,产孢以及致病力等方面发挥重要作用,而外施dsrna具有防治香蕉枯萎菌的巨大潜力。

关键词：香蕉枯萎病菌 myosin-1基因基因敲除氰烯菌酯 dsrna

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番茄早疫病菌dsrna多样性分析

新疆农业科学 2023年第12期60卷 3057-3064页

作者：刘升学李思琪王晓东杨德松石河子大学分析测试中心新疆石河子832000 石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室新疆石河子832003

【目的】研究番茄早疫病菌携带dsrna的多样性,为筛选具有生防作用的真菌病毒提供依据。【方法】从石河子周边加工番茄种植区采集典型症状的组织样品,通过组织分离和单孢分离法获得纯培养;提取dsrna及琼脂糖凝胶电泳明确携带dsrna的情况... 详细信息

【目的】研究番茄早疫病菌携带dsrna的多样性,为筛选具有生防作用的真菌病毒提供依据。【方法】从石河子周边加工番茄种植区采集典型症状的组织样品,通过组织分离和单孢分离法获得纯培养;提取dsrna及琼脂糖凝胶电泳明确携带dsrna的情况。选择6个菌株,通过随机引物RT-PCR、序列分析,研究Blast对携带病毒种类及分类。【结果】从分离到的191株番茄早疫病菌菌株中提取dsrna,有43株中检测到1-4条dsrna条带,带毒率为22.5%。不同菌株携带dsrna的大小不尽相同。对6株菌株的dsrna进行序列测定、组装得到Contigs,Blast比对、分析,鉴定出7种dsrna病毒和2种+ssRNA病毒,分别与整体病毒科(Totiviridae)、双分病毒科(Partitiviridae)、产黄青霉病毒科(Chrysoviridae)、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)和裸露病毒科(Narnaviridae)成员存在序列同源性。【结论】番茄早疫病菌携带dsrna存在多样性,不仅携带多种病毒,而且还存在复合侵染现象。已经检测到的9种病毒分属于Totiviridae、Partitiviridae、Tymoviridae、Tymoviridae和Narnaviridae,有些病毒是已经报道的病毒或其新株系,有些则是未被揭示的新病毒。

关键词：石河子番茄早疫病菌 dsrna 多样性

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昆虫dsrna吸收机理研究现状与展望

山西大学学报(自然科学版) 2022年第3期45卷 816-825页

作者：张建珍史学凯李帅杨霖柴林朱坤炎山西大学应用生物学研究所堪萨斯州立大学山西大学生命科学学院

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种新型的害虫防控策略，由于其具有高效性、专一性和安全性等特点，备受广大植物保护领域学者的关注。双链RNA(double-stranded RNA,dsrna)在昆虫体内的吸收效率是RNAi成功的关键步骤，不同昆虫类群... 详细信息

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种新型的害虫防控策略，由于其具有高效性、专一性和安全性等特点，备受广大植物保护领域学者的关注。双链RNA(double-stranded RNA,dsrna)在昆虫体内的吸收效率是RNAi成功的关键步骤，不同昆虫类群对dsrna的吸收效率存在差异，导致昆虫类群间RNAi效率差异显著，影响了该技术在害虫防治中的适用性。文章重点围绕虫体吸收dsrna的机制、影响dsrna吸收效率的因素及应对策略进行综述，有助于同行学者了解昆虫dsrna吸收机理，探索改进策略，提高昆虫对dsrna的吸收效率，促进RNA干扰技术在农业害虫防治中的应用。

关键词： RNA干扰 dsrna 细胞吸收害虫防治

重组腺相关病毒载体dsrna天然免疫反应的检测

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重组腺相关病毒载体dsRNA天然免疫反应的检测

作者：马婵华侨大学

学位级别：硕士

背景与目的:重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)是具有前景的基因治疗载体之一,但rAAV的免疫毒性限制了其在这个领域的应用潜力。最近的研究表明在rAAV载体转导后的晚期,由rAAV基因组反向末端重复序列(Inverted t... 详细信息

背景与目的:重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)是具有前景的基因治疗载体之一,但rAAV的免疫毒性限制了其在这个领域的应用潜力。最近的研究表明在rAAV载体转导后的晚期,由rAAV基因组反向末端重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)3,端启动子活性转录的负链RNA可与正链RNA退火形成双链RNA(Double-stranded RNA,dsrna),可能是造成转基因难以长期表达,且引起免疫反应的诱因。但目前研究还未有直接证据证明在rAAV转导晚期,确实存在载体相关dsrna,也未见dsrna先天免疫通路分子机制的研究。因此本研究的目的是通过锁式探针-滚环扩增(Pad Lock Probe-Rolling Circle Amplification,PLP-RCA)等技术,确认rAAV载体在转导后可以形成dsrna,并激活dsrna先天免疫反应,同时对dsrna免疫反应的分子机制进行了初步探讨。方法与结果:1.通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)验证了rAAV转导后可以转录形成负链RNA。2.鉴于负链RNA的产生量很少,且因细胞的异质性,PCR检测无法进行单细胞水平的分析,本研究继而比较基于荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)的RNAScope技术和PLP-RCA技术的特异性和灵敏度,结果表明PLP-RCA和RNAScope技术均具有较强的特异性,PLP-RCA的灵敏度较RNAScope更优。使用PLP-RCA技术连续检测携带增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)的rAAV转导Hela细胞后正负链RNA的表达,发现转基因mRNA在转导后1-4d的转录水平很高,从第5 d开始下降,与EGFP表达的趋势一致,mRNA的荧光信号主要分布在细胞核周围。而负链RNA在转导第1 d即可大量检出,在转导第7 d仍能检测到。这一结果支持正负链RNA退火产生dsrna的推测。3.通过免疫荧光法和酶联免疫法证明在rAAV转导的晚期,确实存在rAAV相关dsrna的表达。并使用PLP-RCA检测dsrna免疫传感器黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma Differentiation Associated Gene 5,MDA5)和视黄酸诱导基因蛋白I(Retinoic Acid-inducible Gene I,RIG-Ⅰ)以及dsrna免疫反应产物干扰素β(IFNβ)的表达变化,探索dsrna激活的分子通路。发现在转导8 h时MDA5的表达增加,在第6 d达到峰值,而在相应的时间点基本没有检测到RIG-Ⅰ表达增加,IFNβ的表达也在转导第4 d开始被检测到。提示rAAV相关dsrna的表达,可以激活MDA5先天性免疫反应。最后采用PLP-RCA同时检测rAAV转导晚期正负转录本,以及dsrna先天性免疫相关分子MDA5、RIG-Ⅰ和IFNβ。能够清晰观察到mRNA、负链RNA、MDA5和IFNβ的荧光信号,而RIG-Ⅰ信号未被检测到,进一步说明rAAV相关dsrna的表达,可以激活MDA5先天性免疫反应。结论:1.提供了rAAV转导后可以形成dsrna的实验证据。2.对rAAV相关dsrna诱导的先天性免疫反应分子机制进行了分析,初步认为MDA5参与了该先天性免疫反应的激活。

关键词：正负链RNA dsrna MDA5 RIG-Ⅰ PLP-RCA

V-ATPaseA、AK2和HR3基因dsrna原核表达及其对舞毒蛾生长发育影响

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V-ATPaseA、AK2和HR3基因dsRNA原核表达及其对舞毒蛾生长发育影响

作者：王晓琪东北林业大学

学位级别：硕士

舞毒蛾(Lymantria dispar)是世界性食叶害虫,具有食性杂、生命力强和危害范围广泛等特点,严重危害植物的生长,对我国经济和生态造成巨大的损失。液泡型H-ATP酶(Vacuolar-type proton ATPase)是一种转运真核细胞阳离子的ATP酶,在原生质... 详细信息

舞毒蛾(Lymantria dispar)是世界性食叶害虫,具有食性杂、生命力强和危害范围广泛等特点,严重危害植物的生长,对我国经济和生态造成巨大的损失。液泡型H-ATP酶(Vacuolar-type proton ATPase)是一种转运真核细胞阳离子的ATP酶,在原生质膜和细胞器内膜系统中广泛存在,对昆虫的蜕皮、生殖、生长发育等生理活动产生影响;腺苷酸激酶2(Adenylate Kinase 2,AK2)在线粒体膜间空间的腺嘌呤核苷酸代谢中起着关键作用,影响昆虫的生长发育和细胞增殖;蜕皮激素接受子(Hormone Receptor 3,HR3)作为一种蜕皮转录因子,调控昆虫的蜕皮、表皮形成和卵巢形成等生理活动。本研究以舞毒蛾为研究对象,克隆获得V-ATPaseA、AK2和HR3基因c DNA全长,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析V-ATPaseA、AK2和HR3基因时空表达模式,成功构建dsrna原核表达载体,转入大肠杆菌HT115(DE3),并利用IPTG成功诱导dsrna表达,通过饲喂含有V-ATPaseA、AK2和HR3基因dsrna表达大肠杆菌饲料,探究基因沉默对舞毒蛾幼虫生长发育以及变态发育的影响。主要研究结果如下:1、克隆获得LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因序列,开放阅读框(ORF)分别为1851 bp、1473 bp和729 bp,分别编码616、490和242个氨基酸;蛋白分子量分别为68.04 kDa、26.91 kDa和55.23 kDa;理论等电点(p I)分别为5.24、8.64和6.98;LdV-ATPaseA和LdHR3为碱性蛋白,LdAK2为酸性蛋白;三种蛋白均无信号肽和跨膜结构域。2、采用实时荧光定量RT-PCR分析LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因在不同发育阶段和组织中的表达。结果显示,LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因各个发育阶段均有表达,且均在雌蛹期的表达量较高,分别为对照卵的1.81倍、6.63倍和19.25倍,推测LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因可能参与舞毒蛾生殖功能。LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因各个组织表达量具有特异性,LdV-ATPase和LdAK2在精巢的表达量较高,分别为对照脂肪体的30.80倍和13.68倍;LdHR3在表皮的表达量最高,为对照脂肪体的22.98倍,三个基因在肠道和表皮中表达量相对较高,推测可能影响舞毒蛾取食和蜕皮。3、成功构建LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因原核表达载体,转入大肠杆菌HT115(DE3),通过IPTG诱导表达出相应的dsrna。在舞毒蛾2龄和3龄幼虫期分别饲喂三个基因的dsrna,并检测三个基因的沉默效果。研究结果表明,2龄幼虫期LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因沉默效率分别为96.24%～98.35%,27.06%～85.73%和62.15%～95.64%;3龄幼虫期LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因沉默效率分别为39.71%～63.97%,33.63%～91.45%和61.81%～95.63%。以上结果表明舞毒蛾2龄和3龄幼虫饲喂dsrna靶基因m RNA表达水平均显著低于对照,说明饲喂原核表达dsrna能够有效沉默LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因。4、LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因沉默影响舞毒蛾生长发育。饲喂含有LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因dsrna饲料的幼虫取食量、体重以及体重累计增长率均显著降低。2龄幼虫期和3龄幼虫期起始饲喂3个基因dsrna均可以有效降低雌蛹重;饲喂dsLdAK2和dsLdHR3饲料可导致舞毒蛾雄蛹重显著低于对照。舞毒蛾2龄和3龄幼虫期起始饲喂dsLdV-ATPaseA、dsLdAK2和dsLdHR3死亡率显著升高。2龄幼虫期沉默LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因导致蛹期畸形率显著升高;3龄幼虫起始饲喂dsLdHR3引起蛹期畸形率显著升高,均出现蜕皮缺陷。2龄起始饲喂dsLdV-ATPaseA和dsLdHR3的舞毒蛾化蛹率均显著降低,3龄幼虫期起始沉默LdAK2基因导致化蛹率显著降低。2龄和3龄幼虫期起始基因沉默均致使雌成虫产卵量显著降低。2龄起始LdV-ATPaseA基因沉默导致6龄幼虫期和2龄～6龄幼虫期总发育时间和蛹期发育时间显著延长,饲喂dsLdAK2和dsLdHR3引起6龄幼虫期和2龄～6龄幼虫期总发育历期显著延长;3龄起始饲喂dsLdAK2导致4龄幼虫期和蛹期发育时间显著延长,饲喂dsLdHR3导致蛹期发育时间显著延长。综上所述,通过舞毒蛾2龄和3龄幼虫期起始饲喂LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3dsrna,证实LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因影

关键词：舞毒蛾功能基因生长发育原核表达 dsrna

Isolation and Identification of Virus dsrna from Strawberry Plants

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Agricultural Sciences in China 2007年第1期6卷 86-93页

作者： LI He DAI Hong-yan ZHANG Zhi-hong GAO Xiu-yan DU Guo-dong ZHANG Xin-yu College of Horticulture Shenyang Agricultural University Shenyang 110161 P.R.China

The analysis of virus genome is based on nucleic acid isolation. The aims of this study were to develop a method for isolation and identification of virus double-stranded ribonucleic acid （dsrna） and to elucidate the nucleotide sequences of strawberry virus. Using the modified method, virus dsrna was extracted from strawberry virus indicator plants and cultivated strawberry plants and detected using agarose gel electrophoresis with ethidium bromide staining and reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. The quantity of virus dsrna varied among strawberry cultivars. The quantity of dsrna from in vitro plantlets was higher than that from the young leaves of field plants. For the field-grown plants, there was more dsrna in the young leaves. Virus dsrna extracted from strawberry plants was resistant to deoxyribonuclease Ⅰ （DNase Ⅰ）, but evidently, it became resistant to ribonuclease A （RNase A） only in the presence of 0.5 M NaCl. Its bands in agarose gel could be readily recycled using an agarose gel DNA purification kit. With RT-PCR, the segments of both strawberry mottle virus and Strawberry mild yellow edge virus genomes were amplified by using the virus dsrna recycled from gel or treated with DNase Ⅰ /RNase A as templates. The system developed for dsrna isolation and identification in strawberry plants laid a sound foundation for the work on genome analysis of strawberry virus isolates in China.

关键词： dsrna virus strawberry isolation RT-PCR