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鸡dmrt1基因CRISPR/Cas9载体构建及打靶效率的检测

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中国家禽 2017年第2期39卷 6-9页

作者：杨秀荣邓继贤赵德彪 Mike McGrew Sunil Nandi 蒋和生 Michael Clinton 广西大学广西南宁530004 广西壮族自治区畜牧研究所广西南宁530001 爱丁堡大学罗斯林研究所

dmrt1(Double sex and Mab-3 related transcription factor 1)是鸡性腺分化和发育的关键候选基因,其详细的功能和作用途径还未被阐明。为了解明dmrt1在鸡性腺分化和发育过程中的功能,研究首次利用在线sg RNA平台设计4条鸡dmrt1 sg RNA... 详细信息

dmrt1(Double sex and Mab-3 related transcription factor 1)是鸡性腺分化和发育的关键候选基因,其详细的功能和作用途径还未被阐明。为了解明dmrt1在鸡性腺分化和发育过程中的功能,研究首次利用在线sg RNA平台设计4条鸡dmrt1 sg RNA序列,构建了4个sg RNA表达载体:Guide-1、Guide-2、Guide-3和Guide-4。转染鸡DF-1成纤维细胞后,利用T7E1内切酶的方法检测4个表达载体的打靶效率。结果显示,成功构建了4条正确的鸡dmrt1 sg RNA表达载体,并且都能高效地在DF-1细胞中表达,其中Guide-4表达载体能有效地打靶dmrt1基因,打靶效率为24.82%。研究结果为进一步在鸡胚敲除dmrt1基因,研究其功能奠定了基础。

关键词：鸡性腺分化性别决定 dmrt1 CRISPR/Cas9

中华鳖dmrt1基因在雄性性腺发育中的影响研究

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中华鳖DMRT1基因在雄性性腺发育中的影响研究

作者：王莉上海海洋大学

学位级别：硕士

中华鳖（Pelodiscus sinensis），俗称甲鱼，隶属于爬行纲、龟鳖目、鳖科，是我国南方重要的名特优水产养殖品种。养殖过程中，雄鳖比雌鳖生长快25.0%～30.0%，且雄鳖裙边宽厚，脂肪少，深受市场欢迎，同比单价雄鳖比雌鳖高25%。鉴于此... 详细信息

中华鳖（Pelodiscus sinensis），俗称甲鱼，隶属于爬行纲、龟鳖目、鳖科，是我国南方重要的名特优水产养殖品种。养殖过程中，雄鳖比雌鳖生长快25.0%～30.0%，且雄鳖裙边宽厚，脂肪少，深受市场欢迎，同比单价雄鳖比雌鳖高25%。鉴于此，业内围绕中华鳖性别控制开展了一系列的技术探索，但仍无法使雄鳖苗比例超过65%，这主要是因为中华鳖性别决定分子机制的不清楚。为了揭开中华鳖性别决定分子机理的神秘面纱，本文以雄性性别相关基因dmrt1（double sex and mab3relatated transcription factor1）为切入点，以其cDNA全序列的克隆为基础，研究dmrt1基因在不同组织和不同发育阶段雌雄性腺中的表达情况、细胞定位以及在雌激素诱导的性逆转中的表达变化。本研究旨在初步探索dmrt1基因在中华鳖性别决定中的调控作用，为后续dmrt1的功能研究、中华鳖单性育种及性别决定分子机制研究奠定基础。具体研究结果如下：（1）通过RACE的方法获得了dmrt1基因全长cDNA序列，该序列为2409个碱基，其中开放阅读框（ORF）为1107个碱基，编码368个氨基酸。cDNA全长中还包含5′非编码区的67个碱基，一个长的3′非编码区的1058个碱基，以及终止密码子TAA和多聚A尾巴。根据NCBI网站的氨基酸序列BLAST分析，得到中华鳖与龟鳖类同源性最近，尤其与西部锦龟相似度最高，其次与鳄类动物也有很近的亲缘关系。另外对中华鳖心、肝、脾、肺、肾、肌、卵及睾丸中dmrt1基因mRNA表达检测，发现dmrt1基因只在睾丸组织中大量表达，而其他组织不表达。这说明中华鳖dmrt1基因呈现高度雄性特异性表达。（2）为了研究dmrt1在中华鳖雄性性腺发育中的作用，本实验首先分析了dmrt1在不同发育时期性腺中的表达规律和细胞定位。免疫荧光染色结果显示：在性腺分化之前的第16期雄性性腺中, dmrt1蛋白开始表达，定位在体细胞核中，生殖细胞中未见表达。第17期时，雄性性腺中的dmrt1蛋白表达量显著增加，雌性性腺中未见表达。性腺发育至第19期时，性腺分化已经开始，dmrt1蛋白大量定位于雄性性腺Sertoli前体细胞细胞核中，围绕原始生殖细胞。随着胚胎进一步发育，雄性性腺皮质区进一步退化形成单细胞层，髓质区继续发育形成性索，dmrt1蛋白大量表达，继续定位在Sertoli前体细胞上。而雌性性腺皮质进一步发育，髓质退化并出现空泡结构，未见dmrt1蛋白表达。出生后，中华鳖雄性性腺不断发育形成睾丸，原始性索发育形成曲细精管，由sertoli细胞围绕形成，将各级生殖细胞包绕起来。在1-3龄中华鳖睾丸中，dmrt1蛋白继续分布在曲细精管基部的sertoli细胞上，各级生殖细胞未见表达。在3龄中华鳖卵巢中，未见dmrt1蛋白表达。基于16-19期为中华鳖性别决定和性腺分化的关键时期，以上实验结果表明，dmrt1基因极可能在中华鳖早期雄性性别分化中扮演调控角色。（3）在大部分脊椎动物中，雌激素在性别决定和性腺分化中扮演重要的调控作用。本实验通过对性别分化前胚胎进行雌二醇（E2）和芳香化酶抑制剂（AI）处理，研究雌激素在中华鳖性腺分化中的作用及机理。实验结果显示，与对照组（雌性比例49%）相比，E2处理组中雌性中华鳖仔鳖比例显著增加，高达92.3%;而在AI处理组中，雌性比例显著下调至13.1%。雄性ZZ胚胎经过E2处理后，性腺结构明显雌性化，雄性特异性基因SOX9mRNA表达显著下调;雌性ZW胚胎经过AI处理后，性腺结构呈现雄性化特征，雄性特异性基因SOX9表达显著上升，说明雌激素在中华鳖雌性性别分化中起着重要的调控作用。基于此性激素诱导的性逆转模型的建立，本文还分析了dmrt1基因在性逆转中的表达变化。RT-PCR和免疫荧光染色结果显示：在E2诱导的雄性向雌性性逆转过程中，dmrt1基因表达显著下降;AI诱导的雌性向雄性性逆转过程中，dmrt1基因则被诱导表达。以上结果表明，dmrt1参与中华鳖雄性性别分化过程。本文研究结果表明dmrt1基因为中华鳖雄性特异性基因，参与雄性性腺分化过程，为后续dmrt1的功能研究奠定基础。

关键词： dmrt1 性别决定性腺分化性别逆转中华鳖

尼罗罗非鱼dmrt1、Amh和Cyp11b2抗体制备及其在正常发育和性逆转性腺中的表达研究

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尼罗罗非鱼Dmrt1、Amh和Cyp11b2抗体制备及其在正常发育和性逆转...

作者：王婷茹西南大学

学位级别：硕士

性别决定和性别分化是脊椎动物性腺发育的两个关键事件,涉及多种转录因子、生长因子和性类固醇激素,如dmrt1、Amh、雌激素等。同样作为性类固醇激素的雄激素却不参与性别决定,而是与精子发生有着密切的关系。dmrtl (Doublesex and mab-3... 详细信息

性别决定和性别分化是脊椎动物性腺发育的两个关键事件,涉及多种转录因子、生长因子和性类固醇激素,如dmrt1、Amh、雌激素等。同样作为性类固醇激素的雄激素却不参与性别决定,而是与精子发生有着密切的关系。dmrtl (Doublesex and mab-3related transcription factor1)是DM家族成员之一,是迄今发现的从无脊椎动物到人最保守的与性别决定相关的基因,它所编码的蛋白质包含一个具有DNA结合能力的保守基序,即DM结构域。Amh(Anti-Mullerian Hormone)是一种糖蛋白,属于TGF-β超家族,诱导雄性哺乳动物缪勒氏管的退化。真骨鱼类虽然没有缪勒氏管,但仍然有Amh表达,那么,它在真骨鱼类性别分化中发挥怎样的作用,还有待研究。真骨鱼类雄激素11-酮基睾酮(11-KT)合成所必需的关键酶是Cypllb2(11β-hydroxylase),它直接催化睾酮转变为11p-羟基睾酮,后者再由11β-HSD催化形成11-KT。真骨鱼类雌激素合成所必需的关键酶是Cypl9ala (aromatase),它直接催化睾酮形成雌二醇。dmrt1、Amh和Cyp11b2在真骨鱼类性腺发育中均有重要作用,在尼罗罗非鱼也有相应研究,但因缺乏相应的抗体,导致其蛋白水平的研究几乎无法开展。故本研究制备了尼罗罗非鱼dmrt1、Amh和Cyp11b2多克隆抗体,并对其在正常和性逆转尼罗罗非鱼性腺中蛋白水平的表达进行了初步研究。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)具有生长速度快、性成熟时间短、繁殖周期短等特点,因此,它是研究性别决定及分化的好材料。且本实验室具有成熟的获得尼罗罗非鱼全雄、全雌鱼苗及人工诱导其性逆转(外源雌激素可诱导XY雄鱼向雌鱼逆转,外源雌激素合成酶抑制剂可诱导XX雌鱼向雄鱼逆转)技术,取材方便快捷,故本实验选择罗非鱼作为实验动物。本研究利用RT-PCR扩增出完整的dmrt1、Amh和Cyp11b2ORF(open reading frame),将其连接进pCold I表达载体中进行原核表达,重组蛋白经过镍柱亲和纯化并尿素梯度透析复性后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,利用CNBr激活的Sepharose4B对抗体进行亲和纯化,获得dmrt1、Amh和Cyp11b2多克隆抗体。之后,利用Western blot检测1年龄尼罗罗非鱼性腺组织dmrt1、Amh和Cypllb2表达,免疫组化方法检测其在尼罗罗非鱼不同发育时期精巢和卵巢组织中表达情况,同时利用实验室已有的Cypl9a1a抗体,检测Dmr1、Amh、Cyp11b2和Cypl9ala在性逆转性腺中的表达情况。 Western blot检测发现,dmrtl多克隆抗体可以特异的识别dmrt1重组蛋白,分子量约为35kD,同时,在精巢总蛋白识别单一条带,而在卵巢并未检测到条带,证实dmrt1抗体具有特异性,且dmrt1在尼罗罗非鱼只在精巢特异表达,而在卵巢组织几乎不表达。免疫组化检测发现,dmrt1从性别决定关键时期5dah(dah,days after hatching)开始高表达于XY精巢Sertoli前体细胞,在精巢发育后期表达于Sertoli细胞和输精管上皮细胞。同期的XX卵巢中未见表达。而在外源雌激素E2(Estradiol)诱导XY性逆转过程中,到10-15dah时dmrt1表达量明显降低,到70dah己完全检测不到,Letrozole(雌激素合成关键酶Cypl9a1a抑制剂)诱导XX性逆转过程中,dmrt1在15dah时开始表达,随后表达量逐渐升高,到70dah时与XY对照组没有差别。此结果暗示,dmrt1在尼罗罗非鱼性别决定、精巢维持及性逆转中发挥至关重要的作用。同时,检测性逆转尼罗罗非鱼性腺中Cyp19a1a发现,E2诱导XY性逆转过程中,Cypl9ala在10dah时开始表达,随后表达量逐渐上升,到60dah时与XX对照组没有差别。Letrozole诱导XX性逆转过程中,Cypl9ala表达量逐渐减少并在60dah时消失。有趣的是,在E2和Letrozole处理10-15dah时,性腺组织同时表达dmrt1和Cypl9alao说明在性逆转过程中,存在雌雄通路的对抗作用。 Western blot检测Amh多克隆抗体发现,该抗体可特异识别出Amh重组蛋白,分子量约为54kD,且在精巢和卵巢组织同时检测到单一条带,证实Amh抗体具有特异性,且Amh在尼罗罗非鱼精巢和卵巢组织均有表达。免疫组化检测发现,Amh在5-180dah均高表达于卵巢颗粒细胞和鞘膜细胞,及精巢叶边细胞和Sertoli细胞。免疫组化检测性逆转性腺发现,Amh在Letrozole诱导XX鱼性逆转过程中表达量逐渐升高,而在E2诱导XY鱼性逆转

关键词： dmrt1 Amh Cyp11b2 抗体制备 Western blot 免疫组化正常发育和性逆转性腺

二、三倍体雌性虹鳟（Oncorhynchus mykiss）VG，SOX9，SOX9A2，dmrt1基因表达的比较研究

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二、三倍体雌性虹鳟（Oncorhynchus mykiss）VG，SOX9，SOX9A2，D...

作者：李海龙东北农业大学

学位级别：硕士

虹鳟Onchorynchus mykiss(Walbaum)是重要的冷水性养殖鱼类。为提高产品的质量和群体产量,近年来养殖人工诱导三倍体不育系虹鳟已成为一种发展趋势。由于染色体多倍化,三倍体虹鳟的生殖机制发生了改变,甚至导致了三倍体虹鳟雌性不育。... 详细信息

虹鳟Onchorynchus mykiss(Walbaum)是重要的冷水性养殖鱼类。为提高产品的质量和群体产量,近年来养殖人工诱导三倍体不育系虹鳟已成为一种发展趋势。由于染色体多倍化,三倍体虹鳟的生殖机制发生了改变,甚至导致了三倍体虹鳟雌性不育。性腺是鱼类进行繁殖活动的基础,只有充分了解性腺发育和配子发生的规律,才能对鱼类的繁殖过程更好地进行调控。尽管有关三倍体虹鳟性腺发育已有一些研究,但主要集中于对其整个发育过程的组织学、细胞学、生殖内分泌学等的系统研究,尤其缺乏分子生物学水平的研究。三倍体雌性虹鳟卵巢发育经历了卵原细胞→卵黄发育前期卵母细胞→败育的卵母细胞与卵原细胞簇共存→卵原细胞簇与类生精细胞囊共存→类生精细胞囊的过程,卵巢在发育的中后期具有类雄性化的趋势。本研究以受精后10月龄和20月龄的二、三倍体雌性虹鳟为试验材料,采用流式细胞方法对其倍性进行鉴定;采用波恩氏液固定、常规石蜡切片的方法观察卵巢结构及发育情况。以ef1a基因作为内参,采用EVARE green实时荧光定量PCR技术对二、三倍体雌性虹鳟性腺发育过程中的Vg(卵黄蛋白原),Sox9a2(SRY-box containing gene 9a2),Sox9(SRY-box containing gene 9),dmrt1(doublesex and mab-3-related transcription factor 1)基因的表达(mRNA)情况进行了比较研究,以探讨三倍体雌性虹鳟类雄性化的分子机制。试验结果表明:1.与二倍体相比,10月龄的三倍体雌性虹鳟卵巢发育未见明显异常;20月龄的三倍体雌性虹鳟卵巢出现卵原细胞簇和类生精细胞囊共同存在的嵌合现象,并且在三倍体20月龄的卵巢中,存在因生殖细胞空泡化、溶解、坏死而形成的病灶区。2.三倍体雌性虹鳟中有内源性Vg的少量合成。10月龄的三倍体雌性虹鳟,由于其去雌性化,Vg基因的相对表达量维持在一个很低的水平,仅是同时期二倍体表达量的0.12倍,且差异显著(p10月龄时,三倍体雌性虹鳟sox9a2的表达量显著性低于二倍体(p10月龄和20月龄中基本上是没有太大的变化。***9基因在三倍体雌性虹鳟中与性别分化有关,支持其作为下游的基因起作用。10月龄三倍体雌性虹鳟中,Sox9基因的相对表达量显著性增加(p16倍;而20月龄的三倍体雌性虹鳟中,虽然相对于10月龄来说,Sox9基因的相对表达量有所降低,但仍然维持在一个较高的水平,是同期二倍体的1.84倍(pdmrt1基因与三倍体雌性虹鳟的雄性化有关,支持其作为上游基因起作用。相对于二倍体来说,在10月龄,由于雄性化的开始,dmrt1基因的表达量在三倍体雌性虹鳟中开始增加,且差异不显著,是二倍体的1.14倍(p>0.05);在20月龄中,因雄性化的进程加快,其表达量激增,呈超表达趋势,是同期二倍体表达量的14.5倍(pdmrt1基因可能激活Sox9基因,介导三倍体雌性虹鳟的雄性化。6.在10月龄中,虽然在形态学上,并没有观察到三倍体雌性虹鳟卵巢发育有明显异常,但是基于支持细胞标记基因Sox9和dmrt1在10月龄三倍体雌性虹鳟中的表达情况和趋势可以确定雄性化开始于10月龄。

关键词：雌性虹鳟三倍体 Vg Sox9a2 Sox9 dmrt1

南方鲇dmrt1及其亚型cDNA的克隆和表达的研究

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南方鲇Dmrt1及其亚型cDNA的克隆和表达的研究

作者：刘智皓西南大学

学位级别：硕士

本研究采用RT-PCR与SMARTRACE相结合的方法从南方鲇(Silurus meridionalis)克隆得到dmrt1及其亚型全长cDNA。南方鲇dmrt1(Southern catfish dmrt1，Scdmrt1)cDNA全长1347bp，包括一个编码295个氨基酸的开放阅读框、一个加尾信号(AATAAA)和一个poly(A)尾巴。Scdmrt1亚型cDNA全长1513bp，包括一个编码271个氨基酸的开放阅读框和一个poly(A)尾巴。Scdmrt1及其亚型含有所有DM基因具有的典型特征——DM-domain。序列对比发现scdmrt1及其亚型与革胡子鲇dmrt1最相似，它们同属dmrt1一类群，区别于dmrt2—8。在对scdmrt1及其亚型的序列分析中发现，它们只有3′末端有区别，而在5′端则完全相同。因此我们推测scdmrt1亚型是由于其前体mRNA在3′末端通过选择性剪切产生的。同时，通过扩增scdmrt1基因第4、5个内含子的片段和对其它脊椎动物dmrt1基因结构的分析，我们推测scdmrt1基因可能含有6个外显子，区别于其它脊椎动物的5个外显子。测序结果表明扩增片段中包含了属于第4和第5个外显子部分和内含子的供体位点(gt)和受体位点(ag)。因此我们推测scdmrt1的剪接模式不同于scdmrt1亚型，其产生是由于将scdmrt1前体mRNA剪切掉了第5个外显子，并拼接上最后一个外显子形成，而其亚型则由其前5个外显子拼接而成。另外，我们对scdmrt1及其亚型在南方鲇各组织中的表达进行了研究。研究表明scdmrt1及其亚型在精巢和卵巢均有表达，表达量都是精巢高于卵巢。尤其是scdmrt1亚型在精巢的表达远远高于卵巢。Scdmrt1为雌雄性腺特异表达，而其亚型高表达于性腺，同时在雄鱼微弱表达于肠和肾脏。用雌激素E、芳化酶抑制剂Fadrozole和雌激素受体拮抗剂Tamoxifen对孵化后(days after hatching，dah)5天的南方鲇仔鱼进行浸浴处理20天。65dah时的检测表明在Fadrozole处理组和Tamoxifen处理组，scdmrt1及其亚型的表达上调，而E2组和对照组没有scdmrt1

关键词：南方鲇 dmrt1 亚型选择性剪切诱导性逆转芳化酶表达

鸡胚中RNAi方法的建立及其在鸡dmrt1基因功能研究中的初步应用

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鸡胚中RNAi方法的建立及其在鸡DMRT1基因功能研究中的初步应用

作者：孙小美华中农业大学

学位级别：硕士

本研究围绕种蛋的开窗、干扰载体转染鸡胚以及干扰效果的检测三个方面在鸡胚模型中成功建立了RNAi技术,并使用该技术对鸡的性别决定候选基因之一dmrt1基因功能进行了初步研究。研究结果如下: 1.利用5日龄鸡胚的成活率为指标,以正常孵化... 详细信息

本研究围绕种蛋的开窗、干扰载体转染鸡胚以及干扰效果的检测三个方面在鸡胚模型中成功建立了RNAi技术,并使用该技术对鸡的性别决定候选基因之一dmrt1基因功能进行了初步研究。研究结果如下: 1.利用5日龄鸡胚的成活率为指标,以正常孵化组(组1)为对照,比较机械开窗(组2)、盐酸腐蚀不去壳膜(组3)和去壳膜(组4)三种处理对鸡胚的影响,结果表明机械开窗组鸡胚的成活率最低,仅14.29%;盐酸腐蚀开窗后去壳膜组孵化率最高,达77.27%:机械开窗组与其他三组比较,所得的5日龄成活率较其他三组差,差异极显著(|U|＞U);同时盐酸腐蚀开窗的方法与正常组成活率相比差异不显著;盐酸腐蚀开窗后去壳膜和不去壳膜组之间的差异不显著(|U|＜U)。结果表明,盐酸腐蚀开窗的方法能有效地降低开窗处理对种蛋的影响,是一种安全、有效的方法开窗方法。 2.通过比较电穿孔转染、脂质体介导、直接注射三种将空载干扰质粒转染鸡胚的方法,结果表明电穿孔转染法所得的成活率比其他两种方法的成活率低,差异极显著(|U|＞U),其他两种方法所得的成活率之间的差异不显著(|U|＜U);电穿孔法所获得的转染率明显高于其他两种方法(|U|＞U),其他两种方法间的转染率差异不显著(|U|＜U)。同时,我们发现通过卵黄囊血管注射法,干扰载体在鸡胚的头部、体节中部及尾部均有表达、我们推测载体可能会通过血液循环到达鸡胚其他组织器官;电穿孔方法处理时,载体的表达部位仅局限于两根电极所在的部位。本研究综合各种情况,采用电穿孔法将干扰载体转染鸡胚,但卵黄囊血管注射的方法将干扰载体转染鸡胚可以作为一个很好的转染方法用于以后的试验。 3.将空载干扰质粒转染鸡胚后,在不同时间段取出检测绿色荧光蛋白的表达情况。本试验分别在转染后6h-120h(每次间隔6h)在活体成像系统中检测绿色荧光蛋白的表达情况。最终确定转染12h后绿色荧光蛋白就开始表达,至转染后120h时还有荧光蛋白表达,且转染48h后,质粒的表达率最高。 4.以dmrt1基因为目标,验证上面建立的鸡胚中RNA干扰方法的效果。首先构建了针对dmrt1基因的RNA干扰载体,并采用上述的开窗方法及转染方法将构建的干扰载体转染孵化72h(3日龄)的鸡胚中,收集转染后48h(5日龄)、72h(6日龄)、96h(7日龄)及120h(8日龄)有荧光蛋白表达的活胚,经性别鉴定后,分别选取上述时间段雌、雄鸡胚各三枚(相应的正常组鸡胚),提取全胚的RNA,并反转录为cDNA,用RT-PCR方法分析雄性鸡胚中dmrt1基因和AMH基因以及雌性鸡胚中dmrt1基因和CYP19A1基因的表达情况,结果表明:转染干扰质粒后,雄、雌鸡胚中dmrt1基因的表达水平均有下降,雄性鸡胚中AMH基因在6日龄以后的表达量与正常组相比有增加的趋势,同时各个日龄段雌性鸡胚中的CYP19A1基因的表达水平较正常组的高。本研究成功建立了鸡胚中RNA干扰方法,可以用于后续性别决定和性别分化相关基因功能的研究。同时,本研究建立的种蛋开窗方法将为鸡胚的卵内操作提供更多的便利。

关键词：种蛋开窗 RNA干扰 dmrt1 AMH CYP19A1

青蛤性腺发育及性别相关基因dmrt1和foxl2的表达研究

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青蛤性腺发育及性别相关基因dmrt1和foxl2的表达研究

作者：廖晓婷江苏海洋大学

学位级别：硕士

性别差异是有性生殖生物的基本特征,而性别决定及性别分化是生物个体发育过程中的主要过程。在水产动物中,两性的生长速度不同,因此理解和控制水产动物的性别发育意义重大。青蛤(Cyclina sinensis)是我国重要的养殖经济贝类之一,目前有... 详细信息

性别差异是有性生殖生物的基本特征,而性别决定及性别分化是生物个体发育过程中的主要过程。在水产动物中,两性的生长速度不同,因此理解和控制水产动物的性别发育意义重大。青蛤(Cyclina sinensis)是我国重要的养殖经济贝类之一,目前有关其性别决定及分化的研究较少。本研究以青蛤为实验对象,首先探究了不同月龄青蛤的生长规律,并通过组织学技术观察不同月龄的青蛤内脏团以探究其性别分化发生的最早时间;随后运用RNA-seq对成熟青蛤增殖期的精巢和卵巢进行转录组测序,通过高质量序列拼接组装及基因注释,深入挖掘与性别决定和分化、性腺发育等相关差异表达基因(DEGs)以及调控通路;最后通过对青蛤性别决定和分化相关基因dmrt1(double-sex and Mab-3 related transcription factor)和foxl2(forkhead transcription factor gene 2)的序列进行生物信息学分析,并探究其在青蛤不同胚胎发育阶段、不同组织、不同性腺发育阶段及不同月龄幼贝中的表达差异以初步解析其基因功能。本研究有助于进一步了解青蛤性别决定和分化的分子机制,为后续青蛤遗传选育提供参考资料。具体结果如下:(1)青蛤幼贝生长及性腺组织学研究青蛤幼贝首周年体重、壳重、软体重、壳长、壳高和壳宽六项生长指标增长同步,且呈阶段性增长,增长速率均呈先减小后增加的的趋势,在5-7月龄几乎停止生长。因此推测青蛤幼贝的生长呈季节性变化,且其生长受温度和饵料变化的影响。通过对青蛤3-12月龄去除斧足和肝胰腺的内脏团进行连续的组织学观察,发现在幼贝的内脏团中,三月龄时即可观察到精原细胞、精细胞等雄性特征,而在幼贝达到六月龄时才可观察到卵原细胞等雌性特征,这表明青蛤雄性性别分化时间早于雌性。(2)青蛤雌雄性腺的转录组学分析转录组结果显示总共获得raw reads条数为279,513,030(其中卵巢140,937,740,精巢138,575,290),经数据质控后,共获得clean reads条数为277,871,788(其中卵巢140,109,554,精巢137,762,234),Q30碱基百分比在93.1%以上。使用DESeq2软件,共获得1,440条精巢与卵巢的差异表达基因。对DEGs进行GO和KEGG富集分析,发现DEGs显著富集的term包括细胞周期过程(cell cycle process)、生殖过程(reproductive process)、精子发生(spermatogenesis)等,主要富集的通路有细胞循环(Cell cycle pathway,map04110)、c AMP信号通路(c AMP signaling pathway,map04024)、Fox O信号通路(Fox O signaling pathway,map04068)等。而c AMP信号通路对于生物的性别决定的调控中具有重要作用。通过筛选获得了dmrt1、hpgds、ctsd、smad4、sox30、cdk2、foxl2和gata4基因跟性别决定和分化相关的DEGs以及ccnb3、cdc20和vn跟性腺发育相关的DEGs。(3)青蛤性别相关基因dmrt1和foxl2基因的表达分析采用RACE技术克隆青蛤dmrt1和foxl2基因的cDNA全长。Csdmrt1的cDNA全长为1,611 bp,开放阅读框序列1,137 bp,共编码378个氨基酸;Csfoxl2的ORF区为1,245 bp,编码414个氨基酸,存在保守的FH结构域。分析Csdmrt1和Csfoxl2的时空表达,发现Csdmrt1的表达呈现性别二态性,在精巢内显著高表达,推测该基因参与雄性青蛤的性别决定和分化;两个基因在性腺不同发育时期的表达水平与性腺发育呈正相关,可见Csdmrt1与Csfoxl2基因在青蛤性腺的发育与维持中发挥重要作用,且可能参与生殖细胞的形成;在所有组织中,Csfoxl2基因在斧足的表达量最高,推测Csfoxl2在青蛤神经干细胞的发育及组织的分化和形成中发挥着重要的作用;分析青蛤不同月龄内脏团的Log(dmrt1/foxl2)值的动态变化,发现dmrt1基因在3-5月龄相对于foxl2表达量较高,从6月龄起,foxl2相对于dmrt1开始高表达,与第二章中获得的雌雄青蛤生理上性别分化的时间点相吻合,推测dmrt1和foxl2的相对表达变化能够导致青蛤分化为不同性别。该论文有图20幅,表9个,参考文献153篇。

关键词：青蛤月龄性腺发育转录组 dmrt1 foxl2

黄颡鱼dmrt1基因克隆、表达及与生长性状相关性研究

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黄颡鱼DMRT1基因克隆、表达及与生长性状相关性研究

作者：李林华中农业大学

学位级别：硕士

dmrt基因家族是目前已知控制生物发育的基因家族之一,其编码产物均含有一个具有DNA结合能力的高度保守基序,即DM(果蝇的double-sex基因和线虫的mab-3基因共有的DNA盒基序)结构域,能以锌指结构与特定的DNA序列相结合,调节目的基因转录,... 详细信息

dmrt基因家族是目前已知控制生物发育的基因家族之一,其编码产物均含有一个具有DNA结合能力的高度保守基序,即DM(果蝇的double-sex基因和线虫的mab-3基因共有的DNA盒基序)结构域,能以锌指结构与特定的DNA序列相结合,调节目的基因转录,从而调控下游基因表达,在性别决定与分化过程中具有重要作用。dmrt1 (double-sex and mab3-relatated transcription factorl)是dmrt基因家族的典型代表,广泛参与脊椎与无脊椎动物的性别发育过程,被认为是继SRY与Sox9之后发现的与性别决定相关的又一重要基因。为了阐明dmrt1在黄颡鱼性别决定及分化过程中的作用,给黄颡鱼的单性育种、雌雄生长差异研究以及鱼类的性别决定与性别分化机制研究提供理论基础,本文利用RACE-SMART及RT-PCR技术从黄颡鱼精巢中分离了dmrt1全长cDNA序列(GenBank Accession No. HM245921),对其在胚胎发育阶段、胚后发育阶段、性腺发育阶段和成体阶段的mRNA表达水平及dmrt1多态性与主要生长性状的相关性进行了研究,主要结论如下：1.黄颡鱼dmrt1基因cDNA全长分离及同源性分析黄颡鱼dmrt1 cDNA全长1381bp,其中5’端非翻译区30 bp,3’端非翻译区454 bp[不包括poly (A)],开放阅读框885bp,编码294个氨基酸。黄颡鱼dmrt1序列与其它物种dmrt1进行同源性比较,结果显示,黄颡鱼dmrt1与鲶形目鱼类胡子鲶、尖齿胡鲶及大口鲶dmrt1氨基酸序列的相似性分别为85%、82%和85%,而保守区DM-domian的相似性高达97.2%-100%,与其它鱼类奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼、青鳝、斑马鱼及虹鳟的同源性分别为60%、60%、53%、64%和60%;与小鼠及人的同源性较低,分别为43%和45%。2.黄颡鱼dmrt1基因mRNA表达水平分析采用RT-PCR和Real-time RT-PCR技术对dmrt1在黄颡鱼不同发育阶段及雌雄成体不同组织的表达进行了分析。结果表明,在胚胎发育阶段,整个发育过程都有表达,原肠前期(早期、中期)表达水平显著高于其余各期;在胚后发育阶段,前期1-35天表达水平相对较高,31天其表达量达到最高峰,后期36-51天维持在一个相对较低的水平;性腺发育阶段,雄性精巢发育各期均有表达,Ⅳ期表达量最高,而卵巢发育各期均无表达;雌雄成体阶段,仅在雄性精巢组织特异性表达。3.黄颡鱼dmrt1基因多态性与生长性状的相关性分析利用PCR-SSCP方法对黄颡鱼dmrt1与其主要生长性状的关联性进行了分析,结果显示,在其外显子区域SS1位点检测出一个G→A突变位点,导致其编码的氨基酸由甘氨酸(G)突变成了丝氨酸(S)。该位点由一对等位基因(A和B)控制,表现出3种基因型(AA、BB及AB),不同基因型在群体中与主要生长性状的差异分析表明,雌性群体中,除头长、尾柄长及尾柄高外,AA基因型在全长、体长、体高、体厚及体重上均高于BB与AB基因型个体;雄性群体中,在全长、体高、头长及体重性状上,AA基因型同样均高于BB与AB基因型个体,但两个分析群体均没有达到显著水平(P>0.05);整个群体中,AA基因型个体在全长、体长、尾柄高及体重性状上,显著高于BB基因型(P0.05),该位点可以考虑作为今后黄颡鱼分子标记辅助育种的候选标记,在选育群体中应尽可能地增加AA基因型个体。

关键词：黄颡鱼 dmrt1 基因克隆基因表达生长性状相关性分析

金钱鱼dmrt1和GSDF在性别决定与分化中的功能初步研究

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金钱鱼DMRT1和GSDF在性别决定与分化中的功能初步研究

作者： Umar Farouk Mustapha 广东海洋大学

学位级别：硕士

鱼类性别控制研究是现代水产养殖的热点。金钱鱼(Scatophagus argus,Linnaeus,1766)是一种广盐性鱼类,可作观赏鱼和食用鱼,在养殖群体中性比为1:1。金钱鱼雌鱼的生长比雄鱼快,个体大,有更好经济价值。因此,克隆性别决定主效基因(master ... 详细信息

鱼类性别控制研究是现代水产养殖的热点。金钱鱼(Scatophagus argus,Linnaeus,1766)是一种广盐性鱼类,可作观赏鱼和食用鱼,在养殖群体中性比为1:1。金钱鱼雌鱼的生长比雄鱼快,个体大,有更好经济价值。因此,克隆性别决定主效基因(master sex-determination gene,SD)将有助于金钱鱼的性别控制。本研究旨在研究金钱鱼的性别决定和分化机制,并为以后的单性(全雌鱼)金钱鱼培育提供理论基础。下面为本研究的主要发现:1、金钱鱼性别特异性标记的开发和性别决定候选基因的克隆本研究克隆了金钱鱼dmrt1(dmrt1和dmrt1b)和dmrt3(dmrt3和dmrt3△-Y)的两个亚型。本研究开发了两个位于金钱鱼dmrt3和dmrt1上的性别连锁分子标记,分别命名为dmrt3-Marker-F/R和dmrt1-Marker-F/R。dmrt3-Marker-F/R扩增的片段包含能导致截短型dmrt3(dmrt3△-Y)c DNA提前编码终止的基因组序列。dmrt3-Marker-F/R扩增片段的151和166 bp单核苷酸多态性(SNP)显示雌性个体均为CC GG纯合型,而雄性个体均为CG GA杂合型。标记dmrt3-Marker-F/R扩增片段的166bp是dmrt3基因内含子的起始位置,该处SNP(c.400+1G>A)会导致dmrt3产生截短突变。截短型dmrt3与雄性性别连锁,因此命名为dmrt3△-Y,它的等位基因即正常dmrt3位于X染色体。克隆了一个正常的dmrt1和一个截短的dmrt1b,它们分别编码300和89个氨基酸。多重序列比较分析显示dmrt1和dmrt1b都具有其它物种保守的DM结构域。dmrt1-Marker-F/R引物扩增片段为正常dmrt1外显子2和3之间的片段,PCR产物大小为3.2 kb,且雄性特异,表明dmrt1可能位于Y染色体上。dmrt1b-Marker-F/R引物能够扩增1.5 kb dmrt1b的基因组序列,雌雄均能扩增,雌雄个体序列相似度高达99%,表明dmrt1b并非性别特异,它可能位于X染色体。RT-PCR分析发现dmrt1只在精巢表达,而dmrt3△-Y只在部分精巢微弱表达,而在卵巢不表达。研究初步表明雄性特异dmrt1是金钱鱼的性别决定候选基因。dmrt3-Marker-F/R和dmrt1-Marker-F/R标记均在来自中国5个群体的246尾金钱鱼(113雄和133雌)中验证。后面,dmrt1-Marker-F/R标记又在2000多尾金钱鱼中继续验证。2、金钱鱼中Gsdf的克隆表达分析及dmrt对它的转录调控分析克隆了金钱鱼Gsdf部分c DNA序列,包含了开放阅读框654 bp,编码217个氨基酸。金钱鱼Gsdf的TGF-β含有保守的半胱氨酸残基。组织分布分析表明,金钱鱼Gsdf仅在性腺组织中表达,且其在精巢中的表达显著高于卵巢。通过实时定量PCR分析Gsdf,dmrt1和Sf1在性腺不同发育阶段的表达水平。结果表明,Gsdf在V期精巢中的表达明显低于III期和IV期,但其V期精巢中表达水平远高于II期、III期和IV期卵巢。在卵巢中,Gsdf在II期表达最高。dmrt1在精巢(III期、IV期和V期)的表达显著高于各期卵巢(II期、III期和IV期)。在雌鱼中,Sf1在III期的卵巢中高表达,而在精巢不同时期(在III期、IV期和V期)的表达无差异。在这项研究中,制备了山羊抗金钱鱼Gsdf抗体,免疫蛋白印迹(WB)结果表明,Gsdf在精巢中的表达比卵巢高。免疫组织化学(IHC)研究显示,Gsdf仅在II,III,IV和V期精巢的支持细胞中表达。在雌鱼中,Gsdf仅在I期,II期和III期卵巢的体细胞中表达,而在IV期卵巢几乎检测不到,表明卵巢后期Gsdf的蛋白质表达水平较低。金钱鱼Gsdf启动子的序列分析发现在-2647,-2333,-1789,-1555,-751,-201bp处共有六个Sf1结合位点,在-413 bp处有一个dmrt1结合位点。此外,使用HEK293细胞进行启动子分析显示Sf1单独能以剂量依赖方式激活Gsdf转录,而dmrt1单独不能激活Gsdf基因转录。当dmrt1与Sf1共转染时,dmrt1能够以剂量依赖性方式激活Gsdf表达。dmrt1或Sf1结合位点的突变,都会导致Gsdf启动子活性显著降低。这些结果充分证明dmrt1或Sf1推断的结合位点是激活金钱鱼Gsdf转录调控所必需的。结论:综上所述,在本研究中开发了两个性别特异的标记,表明金钱鱼是XX-XY性别决定系统。dmrt3-Marker-F/R和dmrt1-Marker-F/R分别位于dmrt3和dmrt1基因座内。dmrt1b和dmrt3位于X染色体上,而

关键词： dmrt1 Gsdf 性别决定与分化性别特异分子标记启动子分析性别决定基因金钱鱼