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抗红细胞双价小抗体(diabody)的构建及表达

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海军总医院学报 1997年第4期10卷 210-213页

作者：陈宇萍王琰刘群英朱迎春化冰高荣凯王雅明海军总医院中心实验室海军总医院北京市肿瘤防治研究所

单链抗体(SeFv)是一个重链可变区(V_H),一个轻链可变区V_L由连接肽(Linker)连在一起构成的单价小分子抗体(只有一个抗原结合位点),如将其改为双价,则可使抗体多位点结合抗原,提高抗体的效价,并可进一步构建双特异性抗体,在临床上有广泛... 详细信息

单链抗体(SeFv)是一个重链可变区(V_H),一个轻链可变区V_L由连接肽(Linker)连在一起构成的单价小分子抗体(只有一个抗原结合位点),如将其改为双价,则可使抗体多位点结合抗原,提高抗体的效价,并可进一步构建双特异性抗体,在临床上有广泛的应用前景.单链抗体中V_H和V_L为顺利组合形成F_V结构,连接肽的长度一般不得少于14个氨基酸,连接肽缩短不利于同一肽链内V_H和V_L形成立体结构,则强迫不同分子间V_H和V_L结合,而形成双价F_v分子.本文对一个抗人红细咆的单链抗体进行了改造,经PCR等方法,将其连接肽由17个氨基酸[SR(GGGGS)_3]缩短为6个氨基酸(SRGGGS),强迫不同分子间的V_H和V_L组合成F_v,从而形成双价小分子抗体(diabody).DNA序列测定证实连接肽序列编码六个氨基酸;抗体在大肠杆菌中分泌型表达后,具有血球凝集活性,证明其为双价;进一步用凝胶过滤分析,显示改造后抗体分子的分子量约为原单链抗体的两倍.因抗RBC双价diabody可产生红细胞凝集反应,将抗红细胞与抗血清中异常成分(如抗HB-sAg等)的抗体构建成双特异性diabody,有可能利用简单的血凝实验在临床上进行快速检测和诊断.

关键词： diabody ScFv 抗人RBC 构建表达

人源性抗地高辛单链抗体(scFv)及diabody的获取

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第四军医大学学报 2006年第1期27卷 89-89页

作者：陈宇萍张国民乔媛媛王刚刘玉峰化冰王琰

目的:从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛单链抗体(scFv),并构建双价抗体(diabody).方法:以固相化的Dig对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,4轮后挑取集落,用ELISA法鉴定其特异性,并对抗Dig阳性抗体基因进行DNA指纹分析及测序分... 详细信息

目的:从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛单链抗体(scFv),并构建双价抗体(diabody).方法:以固相化的Dig对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,4轮后挑取集落,用ELISA法鉴定其特异性,并对抗Dig阳性抗体基因进行DNA指纹分析及测序分析,选取活性好的抗体基因进行改造,构建diabody.结果:在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象,获得4株可与Dig特异性结合的人源单链抗体,经DNA指纹分析及测序分析证明为不同抗体基因,[第一段]

关键词：人源单链抗体 diabody 地高辛人源性 DNA指纹分析噬菌体抗体库特异性结合 ELISA法抗体基因测序分析

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双价和双特异性diabody的构建及表达

生物技术通讯 1997年第Z1期8卷 151-151页

作者：陈宇萍王琰刘群英朱迎春化冰高荣凯王雅明王卓智海军总医院北京100037

单链抗体（ScFv）是由一个重链可变区（VH）、一个轻链可变区（VL）经连接肽（linker）连在一起构成的单价小分子抗体,为使其能组装成双价,我们对一个抗人红细胞的ScFv进行了改造,将其连接肽由17个氨基酸[SR（GGGGS）3]缩短为6个氨基酸... 详细信息

单链抗体（ScFv）是由一个重链可变区（VH）、一个轻链可变区（VL）经连接肽（linker）连在一起构成的单价小分子抗体,为使其能组装成双价,我们对一个抗人红细胞的ScFv进行了改造,将其连接肽由17个氨基酸[SR（GGGGS）3]缩短为6个氨基酸（SRGGGS）,强迫不同分子间的VH和VL组合成FV,从而形成双价小分子抗体（diabody）,在大肠杆菌中分泌表达后,显示:①具有血球凝集活性:抗人RBC ScFv虽可与RBC结合。

关键词： diabody 双特异性抗体海军总医院单链抗体小分子抗体分泌表达抗HBsAg 双价连接肽可变区基因

去除Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体原核表达载体的构建及表达

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第10期23卷 946-949页

作者：刘娟妮高瀛岱王金宏邵晓枫范冬梅纪庆熊冬生杨纯正中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020

目的:构建和表达不带Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(diabody[CD3×Pgp]),并测定其生物学活性。方法:利用PCR方法构建不带Etag的diabody[CD3×Pgp]原核表达载体,进行原核表达,制备抗抗CD3scFv亲和层析柱进行纯化,SDS-PAGE鉴定。... 详细信息

目的:构建和表达不带Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(diabody[CD3×Pgp]),并测定其生物学活性。方法:利用PCR方法构建不带Etag的diabody[CD3×Pgp]原核表达载体,进行原核表达,制备抗抗CD3scFv亲和层析柱进行纯化,SDS-PAGE鉴定。通过间接免疫荧光法和竞争性免疫荧光结合流式细胞术(FCM)检测生物学活性。结果:无Etag的diabody[CD3×Pgp]表达载体经测序证实其序列正确。SDS-PAGE电泳显示2条带,相对分子质量(Mr)分别为25000和26000,与预期Mr相符。去除Etag的Dia-body[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合阳性率分别为89.87%和83.95%。竞争结合实验中,与K562/A02和Jurkat细胞竞争后结合率分别为50.25%和43.78%。结论:成功构建了不带Etag的diabody[CD3×Pgp]表达载体、进行原核表达及纯化。不带Etag的diabody[CD3×Pgp]能特异性结合CD3和Pgp靶抗原,Etag标记去除后其生物学活性没有降低。

关键词： PgP CD3 diabody 基因工程抗体

二硫键稳定的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体的构建、表达及活性测定

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生物工程学报 2009年第7期25卷 1042-1048页

作者：苏晔刘娟妮高瀛岱秦立杨铭王金宏许元富邵晓枫纪庆熊冬生杨纯正中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020

向抗CD3/抗Pgp(P-glycoprotein)微型双功能抗体(diabody)中引入二硫键,使diabody两条链以共价键交联,增强其稳定性。用重叠PCR(Overlap PCR)和PCR方法,将抗CD3/抗Pgp diabody中抗CD3或抗Pgp轻重链可变区的适当部位定点突变成半胱氨酸,... 详细信息

向抗CD3/抗Pgp(P-glycoprotein)微型双功能抗体(diabody)中引入二硫键,使diabody两条链以共价键交联,增强其稳定性。用重叠PCR(Overlap PCR)和PCR方法,将抗CD3/抗Pgp diabody中抗CD3或抗Pgp轻重链可变区的适当部位定点突变成半胱氨酸,进行原核表达。表达产物经阳离子层析柱和抗Etag亲和层析柱分离纯化,还原性和非还原性SDS-PAGE电泳鉴定。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FCM)检测生物学活性。将改造前后的两种抗体分别置37oC含0.2%人血清白蛋白(Human serum albumin,HAS)的PBS中孵育,取多个时间点比较两者与两种把抗原的结合能力。基因重组质粒经测序证实序列正确。向抗Pgp轻重链引入突变的diabody(dsPgp-diabody)在原核表达系统中,SDS-PAGE显示纯化后的蛋白二硫键不能配对。而向抗CD3轻重链引入突变的diabody(dsCD3-diabody)能够在原核表达系统中进行可溶性表达,二硫键能够正确配对。并且与改造前的diabody相比,dsCD3-diabody的抗原结合特异性没有改变,抗原结合和竞争活性均无下降。改造前的diabody在37oCPBS(0.2%HAS)中孵育1h后活性即开始下降,24h后活性完全丧失;而dsCD3-diabody孵育72h后活性并无明显下降。本实验成功构建了dsCD3-diabody,并且能够进行可溶性表达。向diabody抗CD3轻重链区引入的二硫键在宿主菌中可以正确配对,抗原结合活性没有明显下降,而稳定性大大增强。向diabody轻重链区引入二硫键,以增强其稳定性的方法是可行的。

关键词：基因工程抗体 diabody 二硫键药物稳定性

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抗地高辛人源小分子抗体的构建

中国免疫学杂志 2009年第2期25卷 167-170页

作者：乔媛媛王琰赵晓航张国民陈宇萍海军总医院中心实验科北京100037

目的:将从大容量噬菌体抗体库中筛选得到的人源抗地高辛单链抗体进行分泌表达,并构建diabody(双体抗体)。方法:将抗地高辛的噬菌体抗体转染HB2151菌(无琥珀抑制基因的宿主菌),IPTG诱导,制备抗地高辛的可溶性单链抗体。选取活性较好的克... 详细信息

目的:将从大容量噬菌体抗体库中筛选得到的人源抗地高辛单链抗体进行分泌表达,并构建diabody(双体抗体)。方法:将抗地高辛的噬菌体抗体转染HB2151菌(无琥珀抑制基因的宿主菌),IPTG诱导,制备抗地高辛的可溶性单链抗体。选取活性较好的克隆进行基因改造,构建diabody表达载体,并分泌表达,表达diabody进行Western blot鉴定。结果:经ELISA结合活性测定,得到了结合活性较高的抗地高辛的可溶性单链抗体;基因改造后,经ELISA及Western blot测定证实获得了结合活性较好的抗地高辛diabody。结论:实验获得了分泌表达活性可靠的人源性抗地高辛抗体,并改造成应用前景较好的diabody,为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源小分子抗体。

关键词：抗地高辛抗体单链抗体 diabody

二硫键稳定的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体稳定性研究

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中国免疫学杂志 2010年第12期26卷 1078-1081页

作者：杨铭程昕杜志荣王彦范冬梅刘娟妮王金宏纪庆高瀛岱中国医学科学院&北京协和医学院血液学研究所天津300020 中国医学科学院&北京协和医学院基础医学研究所北京100730 中国医学科学院&北京协和医学院放射医学研究所天津300192

目的:研究二硫键稳定的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(diabody)在体外和体内的稳定性。方法:将抗CD3/抗Pgp diabody置于37℃含0.2%人血清白蛋白(human serumalbumin,HSB)的PBS中,孵育不同时间后,用流式细胞术(FACS)检测其结合活性。建立K56... 详细信息

目的:研究二硫键稳定的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(diabody)在体外和体内的稳定性。方法:将抗CD3/抗Pgp diabody置于37℃含0.2%人血清白蛋白(human serumalbumin,HSB)的PBS中,孵育不同时间后,用流式细胞术(FACS)检测其结合活性。建立K562/A02裸鼠移植瘤模型,用Cy5荧光标记试剂盒标记抗CD3/抗Pgp diabody,通过尾静脉注射给荷瘤裸鼠,在小动物活体成像系统上动态观察荧光信号。结果:二硫键稳定的抗CD3/抗Pgp diabody(Ds-diabdoy)体外孵育72小时后活性无明显下降,而改造前diabody孵育1小时后活性即开始下降,24小时后活性完全丧失。Ds-diabdoy注射后72小时仍能在肿瘤部位检测到荧光信号,而改造前diabody在注射后24小时肿瘤部位荧光信号消失。结论:Ds-diabdoy较改造前diabody稳定性大大提高。

关键词：药物稳定性 diabody 二硫键多药耐药

二硫键稳定的抗CD3/抗CD19微型双功能抗体的表达及活性测定

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药物生物技术 2014年第5期21卷 389-392页

作者：杨雨琪金锐高子璐岳凯李崴天津医科大学药学院天津300070 天津医科大学肿瘤医院天津300060

构建了抗CD3/抗CD19(diabody)微型双功能抗体,并且为增强其稳定性进一步改造为二硫键稳定的抗CD3/抗CD19(ds-diabody)微型双功能抗体,表达并纯化后测定其生物学活性。构建二硫键稳定的抗CD3/抗CD19表达载体p AYZds CD3CD19,转化感受态... 详细信息

构建了抗CD3/抗CD19(diabody)微型双功能抗体,并且为增强其稳定性进一步改造为二硫键稳定的抗CD3/抗CD19(ds-diabody)微型双功能抗体,表达并纯化后测定其生物学活性。构建二硫键稳定的抗CD3/抗CD19表达载体p AYZds CD3CD19,转化感受态大肠杆菌16C9进行原核表达,分离纯化后,经12%SDS-PAGE及Westen-blot鉴定。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FACS)检测ds-diabody与CD19+Raji细胞和CD3+Jurkat细胞的结合活性。改造后的ds-diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达,ds-diabody在非还原性SDS-PAGE中,在45 k处可见一条带,Westen-blot在同一位置显示有带,在还原性SDSPAGE中45 k处条带消失,在28 k和26 k各有一条带,Western-blot在28 k显示有带,这些均与理论相符,45 k为二硫键稳定的二聚体,在还原剂巯基乙醇作用下二硫键断开,形成28 k和26 k的2条带。FACS检测ds-diabody可与CD19+Raji细胞和CD3+Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制单抗HIT3a和HIT19a与上述细胞的结合。说明改造后的二硫键稳定的抗CD3/抗CD19双功能抗体既能在原核系统中进行可溶性表达,同时又保留了与细胞的结合活性。

关键词： diabody 抗CD3 抗CD19 二硫键药物稳定性

Recombinant approaches to IgG-like bispecific antibodies

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Acta Pharmacologica Sinica 2005年第6期26卷 649-658页

作者： JonathanSMARVIN ZhenpingZHU Department of Anttibody Technology ImClone Systems Incorporated New York NY 10014 USA Department of Anttibody Technology ImClone Systems Incorporated New York NY 10014 USA

One of the major obstacles in the development of bispecific antibodies (BsAb) has been the difficulty of producing the materials in sufficient quality and quantity by traditional technologies, such as the hybrid hybridoma and chemical conjugation methods. In contrast to the rapid and significant progress in the development of recombinant BsAb fragments (such as diabody and tandem single chain Fv), the successful design and production of full length IgG-like BsAb has been limited. Compared to smaller fragments, IgG-like BsAb have long serum half-life and are capable of supporting secondary immune functions, such as antibody-dependent cellular cytotoxicity and complement-mediated cytotoxicity. The development of IgG-like BsAb as therapeutic agents will depend heavily on our research progress in the design of recombinant BsAb constructs (or formats) and production efficiency. This review will focus on recent advances in various recombinant approaches to the engineering and production of IgG-like BsAb.

关键词： bispecific antibodies single chain Fv diabody immunoglobulin G biomedical engineering