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过量表达degq有利于地衣芽胞杆菌表达高温α-淀粉酶

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微生物学杂志 2009年第2期29卷 21-24页

作者：杨艳华牛丹丹石贵阳王正祥江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心浙江无锡214122

研究了过量表达degq对地衣芽胞杆菌表达高温α-淀粉酶的影响。通过PCR从地衣芽胞杆菌基因组中扩增得到degq基因,将其克隆到pHY-P43载体中,得到重组质粒pHY-P43-degq。将其分别转化至地衣芽胞杆菌ATCC14580和B0204中,得到重组菌ATCC14580... 详细信息

研究了过量表达degq对地衣芽胞杆菌表达高温α-淀粉酶的影响。通过PCR从地衣芽胞杆菌基因组中扩增得到degq基因,将其克隆到pHY-P43载体中,得到重组质粒pHY-P43-degq。将其分别转化至地衣芽胞杆菌ATCC14580和B0204中,得到重组菌ATCC14580(pHY-P43-degq)和B0204(pHY-P43-degq)。通过发酵试验,证实degq基因的表达能够显著提高高温α-淀粉酶的表达水平。

关键词： degq 地衣芽胞杆菌 α-淀粉酶

普鲁兰酶基因在重组枯草芽孢杆菌中的表达调控元件优化

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普鲁兰酶基因在重组枯草芽孢杆菌中的表达调控元件优化

作者：邓怡江南大学

学位级别：硕士

长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)来源的普鲁兰酶能够专一性水解支链淀粉的α-1,6-糖苷键,并且酶学性质优异,契合淀粉糖化工艺中的生产要求,具有较高的工业应用价值。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是具有包括安全性高、蛋白分泌... 详细信息

长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)来源的普鲁兰酶能够专一性水解支链淀粉的α-1,6-糖苷键,并且酶学性质优异,契合淀粉糖化工艺中的生产要求,具有较高的工业应用价值。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是具有包括安全性高、蛋白分泌系统完善、培养条件简单等优势在内的表达系统。因此,实现普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达具有重要的学术意义和应用前景。本研究通过优化表达调控元件,分别对*** WB600和*** WB800的组成型及诱导型表达系统进行重组。探究了启动子串联,调控蛋白基因的添加和5’-UTR序列的优化对长野芽孢杆菌普鲁兰酶胞外表达量的影响,并对具有较大潜力的诱导型重组菌株进行了诱导条件的优化,不仅提高了普鲁兰酶的胞外表达水平,也为构建重组枯草芽孢杆菌表达系统提供了思路和借鉴。主要内容如下:(1)依次构建含有1至4个组成型启动子P的片段,获得重组表达载体pMA0911-P-pul、pMA0911-P(D)-pul、pMA0911-P(T)-pul和pMA0911-P(F)-pul。分别在各重组*** WB600和*** WB800中评价了外源蛋白普鲁兰酶的表达情况。其中,重组菌*** WB600/pMA0911-P-pul酶活力最高,达15.1 U·mL。(2)从含有诱导型启动子P的表达载体pMA0911-P-pul出发,依次向该载体中引入基因degq,degU及degS。在重组*** WB800中,degq展现出了对普鲁兰酶表达的正调控效果,将酶活力由4.5 U·mL提高至7.2 U·mL;并且当degq基因插入位点靠近启动子P后,胞外酶活力进一步提高至12.1 U·mL,是出发菌株*** WB800/pMA0911-P-pul普鲁兰酶活力的2.7倍。(3)理性设计mRNA 5’-UTR序列,进一步改造诱导型表达载体pMA0911-P-pul-degq(N),获得4株不同5’-UTR序列的重组菌。其中,*** WB800/pMA0911-P-pul-R4的普鲁兰酶活力达16.8 U·mL,是未优化5’-UTR序列的对照组菌株*** WB800/pMA0911-P-pul-degq(N)酶活力的1.4倍,是出发菌株*** WB800/pMA0911-P-pul酶活力的3.7倍。(4)对引入基因degq,并且优化5’-UTR序列后的重组菌*** WB800/pMA0911-P-pul-R4进行诱导培养条件优化。在诱导前培养9 h后,加入终浓度为5%的蔗糖,最终普鲁兰酶活力能够达到28.7 U·mL,是出发菌株*** WB800/pMA0911-P-pul普鲁兰酶活力的6.4倍。

关键词：枯草芽孢杆菌启动子 degq 5’-UTR 诱导培养

哈氏噬纤维菌CHU0125对结晶纤维素降解的影响以及CHU0052和CHU3006基因功能的研究

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哈氏噬纤维菌CHU0125对结晶纤维素降解的影响以及CHU0052和CHU300...

作者：王志全山东大学

学位级别：硕士

21世纪,能源危机、环境污染成为亟待解决的问题,纤维素作为可再生资源,既可以提供能量,又可以提供化工产品等物资,展现了广阔的应用前景。利用微生物降解等生物技术成为最有利的途径。哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)既不分泌游... 详细信息

21世纪,能源危机、环境污染成为亟待解决的问题,纤维素作为可再生资源,既可以提供能量,又可以提供化工产品等物资,展现了广阔的应用前景。利用微生物降解等生物技术成为最有利的途径。哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)既不分泌游离的纤维素酶系,也没有纤维小体结构,却能够快速彻底的降解结晶纤维素,被称为第三种降解机制。为了研究这种新型的降解机制,本论文包括以下内容：首先,我们利用同源双交换基因敲除的方法筛选可能参与纤维素降解的基因。通过把线性DNA电转入菌体发生同源双交换,从而将目的基因失活的方法,对大量推测可能参与纤维素降解的基因进行了定点敲除,并对敲除株的生长、纤维素降解和运动能力等方面的表型进行了初步研究,以确定这些基因可能参与的生理功能。并进一步对各个基因的性质和对纤维素降解的影响进行了研究。Chu125在NCBI中被标注为肽聚糖关联脂蛋白-Pal。其缺失后导致突变株不能降解结晶纤维素,却对RAC(再生无定型纤维素)、纤维二糖和葡萄糖的利用没有影响,说明chu125是哈氏噬纤维菌降解结晶纤维素的关键基因。对突变株的纤维素酶活、纤维素吸附能力、软硬琼脂扩散能力和玻片表面的滑动能力的研究表明其性质与野生菌株没有明显差别,排除了与结晶纤维素降解能力缺失的关系。SEM结果显示菌体在滤纸表面的排列不如野生型菌株排列整齐,即使到生长后期菌体也比较稀疏。最后通过提取外膜蛋白进行SDS-PAGE,发现CHU125蛋白条带清晰可辨,在突变株图谱中缺失,同时发现了另外一个蛋白条带的量在突变株中明显减少,经质谱鉴定为CHU522,说明CHU125的缺失影响了其它蛋白。CHU125缺失突变株对外界环境压力(结晶紫、H202、抗生素等)较野生菌敏感程度加大,而且在有机物培养基中的生长较野生菌出现了较大缺陷,推测CHU125参与维持外膜蛋白的完整性和物质运输。对该蛋白进行异源表达,结果得到包涵体而导致实验失败。对该基因进行分析,发现该蛋白含有三个保守的结构域：位于N端的TPR结构域,中间位置的PD40结构域,C末端位置的ompA-like结构域,结构类似于pal或MotB蛋白,并进一步对可能与其发生相互作用的其他基因进行了初步研究,猜测哈氏噬纤维菌中Pal可能是通过影响纤维素降解产物的运输而导致突变株失去了降解结晶纤维素的能力。HtrA (Highemperature requirement A)家族的丝氨酸蛋白酶对细菌抵抗外界压力尤其是耐高温生长中发挥了重要作用,在哈氏噬纤维菌的基因组中有两个同源蛋白的编码基因chu052和chu006,两者相似度(identity)高达79%。为了了解该家族蛋白酶的生理功能和对哈氏噬纤维菌降解纤维素的影响,本实验利用同源双交换基因敲除构建了三个突变株：△0052、△3006两个单基因敲除突变株和A3006-0052双基因缺失突变株。A0052和A3006-0052突变株都对高温敏感,33℃时不能生长,而在降低温度的情况下生长能力有很大程度的回复。虽然△3006在适温30℃和稍高温度下的生长与野生型菌株相当,展现了耐高温性质,却在降低温度的情况下生长速度逐渐减慢,甚至在21℃生长出现了明显的延迟。在30℃恒温条件下仅变动培养基的pH值,发现△3006突变株生长状况较野生菌株和△0052突变株发生明显的波动,暗示了CHU006在pH压力条件下的作用。△0052和△3006-0052突变株的纤维素降解能力、纤维素比酶活和运动能力都明显下降,而△3006与野生型菌株差别不大。半定量RT-PCR结果显示两个基因有着不同的表达模式,chu006是诱导型,而chu052本底表达量就很高。△3006-0052双基因缺失突变株在适温(30℃)、液体条件下培养时菌体形态发生了很大的改变,有的菌体出现裂解;在高温(37℃)、固体滤纸条件下,其形态也发生了改变,出现很多环状的结构,而两个单基因缺失突变株在两种条件下都没有发现明显的变化。提取外膜蛋白进行SDS-PAGE,发现双基因缺失突变株的条带较野生型发生了很大的改变,而两个单基因敲除突变株没有显著变化,暗示了两蛋白酶功能互补性,并对差异蛋白进行了质谱鉴定。通过对chu052和chu006基因序列分析和功能的研究,对其在NCBI中注释进行了更正,认为两个基因在结构(氨基酸序列)上均类似于degq,而在功能上CHU006更接近于degq,并非标注的DegP,CHU052在热激条件下起着更为关键的作用,其功能上更接近DegP。研究表明CHU052是高温下生长必需的蛋白酶,在高温生长条件下CHU006对CHU052的缺陷有一定弥补作用。研究还首次发现CHU006与菌体在低温下的生长密切相关,并与菌体的耐酸和耐碱性相关。

关键词：哈氏噬纤维菌纤维素降解滑动肽聚糖关联脂蛋白Pal HtrA家族丝氨酸蛋白酶 DegP degq

抑制差减杂交法分离干旱胁迫下玉米幼苗特异表达cDNA

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抑制差减杂交法分离干旱胁迫下玉米幼苗特异表达cDNA

作者：倪娜四川农业大学

学位级别：硕士

玉米起源于南美洲高温多湿的热带地区耐旱性较差。随着生态条件的恶化干旱作为主要的非生物胁迫因子之一已成为许多国家和地区玉米生产的主要限制因素。研究表明，玉米不同自交系的耐旱性存在显著差异。但是，耐旱性是众多形态、生理和... 详细信息

玉米起源于南美洲高温多湿的热带地区耐旱性较差。随着生态条件的恶化干旱作为主要的非生物胁迫因子之一已成为许多国家和地区玉米生产的主要限制因素。研究表明，玉米不同自交系的耐旱性存在显著差异。但是，耐旱性是众多形态、生理和生化特性协同作用的结果，而且不同的基因型可能涉及不同的胁迫应答方式，加之环境因素的干扰，耐旱性的鉴定在通常条件下比较困难。目前，玉米耐旱性分子遗传机制研究报道相对较少，基本还停留在耐旱性的生理生化机制和鉴定指标上。本研究用18％PEG-6000对耐旱性较强自交系“81565”进行模拟干旱处理，用抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)技术研究干旱与正常浇水对照的mRNA差异表达，发现B1、A2、C4、E4和F4五个干旱上调表达的差异片段。序列分析和同源性比对表明，B1与水稻OSJNBa0072F16.5蛋白预测获得的mRNA序列有88％的相似性，该蛋白具有属于丝氨酸蛋白酶类的类胰蛋白酶(degq)结构域。A2与水稻中一段mRNA序列有91％的相似性，该序列编码具有NADH脱氢酶活性的还原酶。C4序列包含于编码玉米磷酸甘油酸变位酶基因的外显子6区域，与玉米不依赖于辅因的磷酸甘油酸变位酶完整保守结构区mRNA序列有97％的相似性。E4与玉米PCO066914 mRNA序列有99％的相似性;F4与玉米PCO113764 mRNA序列相似性达100％。根据各自序列相似同源基因的功能推测，C4、E4和F4三个片段在干旱胁迫下的差异表达可能与“81565”的耐旱机制有关，其应答过程可能涉及到不需能的受损蛋白质降解，胁迫下呼吸作用和光合作用效率的最大化以及与碳代谢相关的能量产生与转化。

关键词：玉米干旱抑制差减杂交 degq NADH脱氢酶磷酸甘油酸变位酶