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中华实验外科杂志 2010年第8期27卷 1139-1141页

作者：杨立峰叶定伟姚旭东张世林戴波张海梁复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科上海200032

目的观察雄激素受体反应元件陷阱核酸（ARE decoy DNA）在LNCaP细胞中的致凋亡作用及下游信号通路.方法根据ARE-Ⅰ、ARE-Ⅱ人工合成decoy核酸,进行部分和完全硫代修饰,应用凝胶阻抑分析方法检测4种decoy核酸与雄激素受体（AR）特异性... 详细信息

目的观察雄激素受体反应元件陷阱核酸（ARE decoy DNA）在LNCaP细胞中的致凋亡作用及下游信号通路.方法根据ARE-Ⅰ、ARE-Ⅱ人工合成decoy核酸,进行部分和完全硫代修饰,应用凝胶阻抑分析方法检测4种decoy核酸与雄激素受体（AR）特异性结合.选择特异性结合最强decoy核酸通过LipofectinTM 2000转染细胞,MTS法检测转染后细胞增殖能力,共聚焦显微镜观察细胞形态学改变,Western blot检测细胞内蛋白表达.结果 ARE-Ⅱdecoy转染后MTS检测细胞A值0.500±0.013（48 h）,与对照decoy转染组0.750±0.055（48 h）比较差异有统计学意义（P＜0.01）.细胞核皱缩,核染色质分块,DNA电泳出现阶梯状ladder,证明细胞发生凋亡.Western blot检测发现细胞内p-Akt表达明显降低（P＜0.05）,Akt信号通路被抑制,促进了细胞凋亡.结论 ARE-Ⅱdecoy核酸明显抑制前列腺癌LNCaP细胞生长,促进细胞凋亡,改变细胞内信号通路.

关键词：前列腺癌雄激素受体 LNCaP decoy核酸

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以转录因子AP1为靶的decoy核酸体内外抗肿瘤研究

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生物化学与生物物理进展 2004年第1期31卷 27-31页

作者：王雪根叶青陈武领冯莹韦策刘晖欧阳平凯南京凯基生物科技发展有限公司南京210009 南京工业大学制药与生命科学学院南京210009

合成了双链寡聚核苷酸———decoy核酸 ,其与靶转录因子AP 1有高亲和性 ,可进入细胞作为decoy顺式元件 ,通过抑制特异的转录因子和调控区域的结合 ,调控基因转录而改变基因的表达 .在体内外抗肿瘤试验中 ,decoy核酸有显著抑制肿瘤细胞... 详细信息

合成了双链寡聚核苷酸———decoy核酸 ,其与靶转录因子AP 1有高亲和性 ,可进入细胞作为decoy顺式元件 ,通过抑制特异的转录因子和调控区域的结合 ,调控基因转录而改变基因的表达 .在体内外抗肿瘤试验中 ,decoy核酸有显著抑制肿瘤细胞增殖的作用。

关键词：转录因子AP-1 decoy核酸肿瘤转录调控

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decoy核酸在LNCaP细胞中作用机制研究

Decoy核酸在LNCaP细胞中作用机制研究

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作者：杨立峰复旦大学

学位级别：硕士

目的前列腺癌在接受内分泌治疗2年左右,约50%的患者出现激素抵抗,进展为去势治疗失败前列腺癌(CRPC)。即使在CRPC状态下,雄激素受体(AR)作为转录因子仍然持续激活下游基因的转录,产生PSA。通过雄激素受体反应元件陷阱核酸(ARE decoy DNA... 详细信息

目的前列腺癌在接受内分泌治疗2年左右,约50%的患者出现激素抵抗,进展为去势治疗失败前列腺癌(CRPC)。即使在CRPC状态下,雄激素受体(AR)作为转录因子仍然持续激活下游基因的转录,产生PSA。通过雄激素受体反应元件陷阱核酸(ARE decoy DNA)在LNCaP细胞中作用,阻断AR激活,研究其对下游信号通路的影响。方法根据根据目前已知的位于PSA基因启动子-170附近的ARE-Ⅰ序列(AGAACAgcaAGTGCT)和位于PSA基因启动子-394附近的ARE-Ⅱ序列(GGATCAgggAGTCTC)，人工合成decoy核酸,并进行部分硫代和完全硫代修饰,同时双侧末端标记生物素或FITC。对照组核酸两端分别标记生物素或FITC。应用凝胶电泳阻抑分析方法(EMSA)检测4种人工合成的decoy核酸与LNCaP细胞核蛋白提取物特异性结合能力,模拟其与雄激素受体(AR)特异性结合情况。根据实验结果选取与核蛋白特异性结合最强的decoy核酸,通过脂质体Lipofectin2000进行细胞转染,转染后通过MTS法检测各组LNCaP细胞增殖能力;使用共聚焦显微镜观察转染前后细胞的形态学改变;通过提取转染后细胞内DNA,行水平电泳检查有无凋亡改变;通过western-blot检测转染后细胞内蛋白表达情况及信号通路改变。结果1凝胶电泳阻抑分析方法(EMSA):以1nM,10nM,100nM分别作为探针浓度,通过EMSA检测四种修饰过的decoy核酸,完全硫代的ARE-Ⅰ、ARE-Ⅱdecoy核酸相对于部分硫代修饰的ARE-Ⅰ、ARE-Ⅱdecoy核酸以及对照核酸,与LNCaP细胞核蛋白特异性结合能力更强,且探针浓度越高与核蛋白结合能力越强。完全硫代修饰后decoy核酸稳定性强于部分硫代修饰。2.细胞增殖试验：以2uM为decoy转染浓度,通过Lipofectin2000将四种修饰后decoy核酸转染入LNCaP细胞,转染率约为30%。转染24-72小时后,使用MTS法检测细胞增殖活性发现,完全硫代修饰的ARE-Ⅱdeoy相对于对照组核酸对LNCaP细胞增殖抑制效果最强(P小于0.01),在转染后48小时,完全硫代修饰的ARE-Ⅱdecoy核酸对LNCaP细胞的增殖抑制作用达到最强,到72小时后抑制作用逐渐减弱。3.细胞形态学观察：使用共聚焦显微镜观察转染前后细胞形态学改变,发现转染完全硫代ARE-Ⅱdecoy后的LNCaP细胞,细胞核在DAPI染色下呈蓝色,细胞核内见绿色的荧光小点,为FITC标记的完全硫代ARE-Ⅱdecoy核酸,表明decoy核酸已转染进入细胞核内发挥作用,转染率为30%。转染后的细胞相对转染前,细胞数明显减少,细胞膜隆起,胞核明显皱缩,出现核染色质分块,呈现凋亡改变。4.DNA水平检测：提取转染完全硫代ARE-Ⅱdecoy组,转染对照核酸组,以及正常LNCaP细胞内DNA,水平电泳发现转染完全硫代ARE-Ⅱdecoy组,出现阶梯状的DNA ladder,表明转染后细胞发生凋亡改变,而对照组与空白组未出现上述改变。5. Western-blot检测蛋白水平改变：在LNCaP细胞中,转染前后Akt水平没有明显变化,但转染完全硫代ARE-Ⅱdecoy后细胞内的p-Akt表达明显降低,Akt信号通路被抑制,促进了细胞凋亡过程,同时转染后细胞内的PSA蛋白表达水平也较未转染前明显下降。结论完全硫代修饰的ARE-Ⅱdecoy核酸与雄激素受体结合能力最强,且完全硫代修饰的decoy核酸比部分硫代修饰的decoy核酸稳定性更强。转染完全硫代修饰的ARE-Ⅱdecoy核酸明显抑制LNCaP细胞的生长,促进细胞凋亡,抑制了细胞p-Akt蛋白的表达,使细胞内PSA蛋白水平明显下降,改变了细胞内信号通路。decoy核酸为今后治疗去势治疗失败前列腺癌(CRPC)提供了靶点。

关键词：雄激素受体 LNcaP decoy核酸 Akt

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靶向转录因子AP-2的decoy核酸对肿瘤细胞增殖的抑制作用

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中国生物化学与分子生物学报 2004年第4期20卷 523-527页

作者：王雪根叶青陈武领冯莹韦策刘晖欧阳平凯南京凯基生物科技发展有限公司南京210009 南京工业大学制药与生命科学学院南京210009

ecoy核酸是与靶转录因子具有高亲和性的双链寡聚核酸 ,通过竞争性抑制转录因子与调控区域的结合 ,调控转录来改变下游基因的异常表达 ,从而抑制肿瘤恶性增殖 .用MTT比色法 ,体外筛选结合转录因子AP 2的decoy核酸药物 ,结果K2 0 6对多种... 详细信息

ecoy核酸是与靶转录因子具有高亲和性的双链寡聚核酸 ,通过竞争性抑制转录因子与调控区域的结合 ,调控转录来改变下游基因的异常表达 ,从而抑制肿瘤恶性增殖 .用MTT比色法 ,体外筛选结合转录因子AP 2的decoy核酸药物 ,结果K2 0 6对多种肿瘤细胞生长有显著的抑制作用 ,在异植人肿瘤细胞NCI H4 6 0的裸鼠模型中 ,静脉注射高中低三剂量组的decoy核酸K2 0 6 ,抑瘤率分别达 71 8%、6 4 4 %及 5 7 3% (V V) .通过凝胶阻抑试验 ,验证了K2 0 6与转录因子产生特异性结合 .

关键词：转录因子AP-2 decoy核酸转录调控肿瘤

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