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拟南芥抗葱链格孢侵染基因的差异表达

拟南芥抗葱链格孢侵染基因的差异表达

作者：瓮巧云河北农业大学

学位级别：硕士

本文在对拟南芥不同生态型接种不同植物病原菌后的抗病反应基础上对抗感表现不同的生态型的抗性机制及抗性相关基因的差异表达进行了研究,结果如下: 测定拟南芥11个生态型接种8种不同植物病原菌后发现,供试拟南芥对田璇花白粉病菌、白... 详细信息

本文在对拟南芥不同生态型接种不同植物病原菌后的抗病反应基础上对抗感表现不同的生态型的抗性机制及抗性相关基因的差异表达进行了研究,结果如下: 测定拟南芥11个生态型接种8种不同植物病原菌后发现,供试拟南芥对田璇花白粉病菌、白菜黑斑病菌、玉米大斑病菌和棉花黄萎病菌均表现为非亲和反应。转基因NahG和生态型Col、Shakh-dara以及生态型Nd-1、WS-2、Kas-1分别对丝瓜白粉病菌、葱链格孢、葫芦白粉病菌和番茄早疫病菌表现为亲和反应;生态型Ler对葱链格孢和番茄早疫病菌表现亲和反应:而生态型C24、Est-1、Ws-0和Bay-0对丝瓜白粉病菌、葱链格孢、葫芦白粉病菌和番茄早疫病菌均表现为非亲和反应。转基因拟南芥NahG和生态型WS-2、Shakh-dara接种葱链格孢后,细胞防御酶系活性和非酶类物质丙二醛含量有规律性的变化,其中SOD、CAT、PPO和MDA含量变化与拟南芥抗葱链格孢侵染密切相关;POD和PAL活性变化与拟南芥抗葱链格孢侵染的关系尚不明确。利用改良的ddrt-pcr差异显示技术,从接种葱链格孢的拟南芥cDNA中分离得到了135条差异表达片段。反式Northern杂交表明,38个差异表达片段的二次扩增产物与对照或接种处理的cDNA杂交有阳性反应,阳性率为28.1%。将获得的阳性差异表达片段与特异于病程相关蛋白基因PR-1、PR-2、PR-3、PR-4、PDF1.2的探针进行反式Northern杂交检测,均没有产生阳性信号。对其中的8条差异表达片段进行克隆、测序、同源性分析后发现,抗感拟南芥生态型受葱链格孢侵染后不仅诱导了呼吸过程中有关基因的表达如nad4L,同时还诱导了一些与细胞壁构建相关基因(如Slal)、蛋白质或缩氨酸水解等有关基因的表达。通过RACE技术获得了片段47的5'端序列。同源性分析表明,该序列与烟曲霉、粗糙脉孢菌和酿酒酵母菌、酵母的细胞骨架组装控制蛋白Slal的同源性分别为77%和36%;与红松ORF64c、人类含有SH3域的蛋白SH3P17和海胆src家族蛋白酪氨酸激酶等的同源性分别为86%、32%和43%。

关键词：拟南芥葱链格孢防御酶非酶类物质差异表达 ddrt-pcr RACE

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萝卜抽薹生理特性与相关基因的差异表达研究

萝卜抽薹生理特性与相关基因的差异表达研究

作者：张慧蓉南京农业大学

学位级别：硕士

萝卜(Raphanus sativus L．)是我国栽培历史悠久的大众化蔬菜之一，在蔬菜生产与供应中起着重要的作用，但是生产中常见的先期抽薹会给生产造成严重损失。抽薹是植株春化向生殖生长转变后的重要发育阶段，与春化作用、花芽分化和开花具... 详细信息

萝卜(Raphanus sativus L．)是我国栽培历史悠久的大众化蔬菜之一，在蔬菜生产与供应中起着重要的作用，但是生产中常见的先期抽薹会给生产造成严重损失。抽薹是植株春化向生殖生长转变后的重要发育阶段，与春化作用、花芽分化和开花具有密切的联系。所以无论从形态，还是生理生化代谢都发生了深刻的变化，而且在花芽分化和抽薹开花等发育过程中，会因一些重要相关功能基因的表达，最终引起多种代谢酶类的活性、成分以及体内小分子物质含量的变化。本文首先对萝卜花芽分化的形态进行观察研究，以准确把握研究抽薹发育的切入点。结果发现，萝卜茎端生长锥的分化可分为营养生长、生长锥伸展和花原基分化三个时期;又根据单花器官分化的各时期典型特征，详细地划分为十个级别，包括萼片原基、雄蕊原基、雌蕊原基和花瓣原基的分化。与前人结论有所不同的是，本研究更突出了单花器官分化过程的连贯性。本文后续研究中抽薹材料的选择标准正是利用这一结果，稍作变动得到的。另外研究还发现低温处理萌动种子能够加快花芽分化进程，在一定范围内，处理时间与花芽分化的速度有关。通过对春萝卜抽薹前后叶片多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶活性和可溶性糖含量的变化研究表明，PPO和ASP在抽薹发育过程中，酶活性互相交替，再次证实了呼吸代谢的复杂性。PPO活性呈现持续升高趋势，特别是以现蕾临界期和抽薹期为转折点的活性上升剧烈;ASP活性变化则与之相反，呈现“下坡型”曲线，现蕾临界期活性开始明显下降，待抽薹开花后则达到最低值;可溶性糖含量现蕾临界期或前期含量达到最低值，现蕾期升高，随后呈平缓上升趋势，待抽薹开花时达到峰值。采用基因差异显示技术研究了萝卜花芽分化和抽薹过程中基因的差异表达，考虑到不同研究材料在利用该技术的特异表现，首先对反应体系及扩增程序的退火温度进行优化，筛选得到一套较适于萝卜ddrt-pcr分析的参数因子组合;然后分别以“短叶13”花芽分化和“扬花萝卜”、“BYC”抽薹3个阶段的茎尖、叶片为材料，选用3个锚定引物和26个随机引物共作了390个反应，克隆测序得到不同类型差异条带41个。通过登录GENEBANK分别对核苷酸(Blast)和氨基酸(Blast)的同源性比较发现，其中一些差异片段与拟南芥叶绿体基因组DNA、拟南芥未知蛋白、拟南芥At3g23000基因、芜青叶绿体petA基因、拟南芥羧酯水解酶、Heritiera littoralis 18S核糖体RNA基因、Lactuca sativa NADH脱氢酶亚组2、拟南芥CIPK7、甘蓝型油菜线粒体DNA、人类3号染色体克隆等的同源性高达88％以上，另外一些差异片段同源

关键词：萝卜花芽分化抽薹生理特性 ddrt-pcr

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玉米抗灰斑病相关基因筛选及防御酶活性分析

玉米抗灰斑病相关基因筛选及防御酶活性分析

作者：马莹莹吉林农业大学

学位级别：硕士

玉米灰斑病是我国东北地区主要叶部病害。本研究通过分析玉米灰斑病菌Cercosporazeae-maydis侵染玉米自交系抗病自交系78599-1、OH43HtN和感病自交系掖478、K12后，植物体内保护酶系的动力学反应、丙二醛（MDA）的含量变化及抗病相关基... 详细信息

玉米灰斑病是我国东北地区主要叶部病害。本研究通过分析玉米灰斑病菌Cercosporazeae-maydis侵染玉米自交系抗病自交系78599-1、OH43HtN和感病自交系掖478、K12后，植物体内保护酶系的动力学反应、丙二醛（MDA）的含量变化及抗病相关基因表达变化，研究玉米与C. zeae-maydis互作的抗性生理机制;利用ddrt-pcr技术获得玉米抗灰斑病相关基因，对玉米抗灰斑病的分子机制进行了初步分析。主要研究结果如下： 1、本试验采用ddrt-pcr技术，选用16对随机引物分析抗/感玉米灰斑病材料接种C. zeae-maydis不同时间基因表达变化，筛选获得46条差异条带，回收、二次扩增后，获得40条差异片段，回收率高达87%，表明筛选玉米抗灰斑病的mRNA差异显示技术体系成熟。 2、利用反式Northern杂交检测，获得阳性片段26条，阳性率为65%。成功将其中19条片段克隆到T-Vector pMD19且测序成功。其中，抗性材料78599-1和OH43HtN分别有6条和5条片段，感病材料掖478和K12分别有5条和3条片段，感病材料差异表达条带的数目比抗病材料少。 3、利用NCBI的Blast软件对所获得的阳性基因片段进行序列比对分析，结果发现，在掖478、OH43HtN均发现了玉米Mu转座子插入Mu1007701侧翼序列的同源片段及玉米光诱导蛋白CPRF-2基因同源片段;在掖478和78599-1中分离获得了酰氨基酸释放酶相关基因同源片段;在掖478中发现玉米MTN3基因同源片段;在OH43HtN中分离到酰基辅酶A结合蛋白基因同源片段;在K12中分离到CONS TANS-CO5家族的基因同源片段;在78599-1中获得假定蛋白基因同源片段。结果表明，抗感材料在接种灰斑病原菌后其诱导的表达基因不同，且同一基因发挥的作用不同。 4、本试验发现不同抗性自交系在接种C. zeae-maydis后其相关防御酶活性变化显著，抗性自交系接种病原菌后，PAL、POD和CAT的酶活性明显增加且高于感病自交系，且酶活性升高的持续时间长于感病自交系，表明POD、PAL和CAT具有抗病作用。抗病自交系的丙二醛含量明显低于感病自交系，表明丙二醛含量变化与抗病程度呈负相关。 5、RT-pcr表达分析发现，接种C. zeae-maydis后，78599-1的CAT基因表达量高于掖478和K12，OH43HtN的CAT表达量变化不明显，然而，78599-1APX基因的表达量明显低于OH43HtN，表明不同抗性自交系抵御C. zeae-maydis侵入的信号途径不同。

关键词：差异表达片段防御酶 ddrt-pcr C.zeae-maydis

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基因差异表达分析技术进展

生命科学研究 2004年第S2期8卷 48-52页

作者：龙桂友饶力群湖南农业大学园艺园林学院湖南农业大学理学院湖南长沙410128

比较了目前几种主要的基因差异表达分析技术并简要地归纳了各种基因差异表达分析方法的特点,重点介绍了经典的基因差异表达分析技术———差异显示技术及其改进与完善,最后根据差异显示技术在高等植物方面已取得的成就乐观地展现了该技... 详细信息

比较了目前几种主要的基因差异表达分析技术并简要地归纳了各种基因差异表达分析方法的特点,重点介绍了经典的基因差异表达分析技术———差异显示技术及其改进与完善,最后根据差异显示技术在高等植物方面已取得的成就乐观地展现了该技术在园艺植物研究上的应用前景.

关键词：基因差异表达差异显示 ddrt-pcr mRNA 基因表达

双梯度超薄胶PAGE分离DNA及其银染与回收

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生物技术 2001年第4期11卷 45-47页

作者：朱新产王宝维王世成莱阳农学院动科系分子生物学研究室山东莱阳265200

双浓度梯度超薄胶PAGE分离ddrt -pcr扩增产物表明 ,在 30cm长的凝胶板上能清晰分辨长度仅差 1bp的DNA ,清楚的显示出 10 0多条分离谱带。

关键词：双梯度PAGE ddrt-pcr 银染 DNA 分离

双梯度超薄胶PAGE分离DNA及其银染与回收

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西北农业学报 2002年第1期11卷 20-23页

作者：朱新产王宝维张涌莱阳农学院动科系分子生物学研究室山东莱阳265200 西北农林科技大学陕西杨凌712100

双浓度梯度超薄胶 PAGE分离 ddrt-pcr扩增产物表明 ,在 3 0 cm长的凝胶板上能清晰分辨长度仅差 1 bp的 DNA,清楚的显示出 1 0 0多条分离谱带 ,并可直接从银染 PAGE胶中回收 DNA谱带。简便节省。

关键词：双梯度超薄胶PAGE DNA 分离银染回收 ddrt-pcr

陕西茶树种质资源抗寒性评价及冷胁迫基因差异表达研究

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陕西茶树种质资源抗寒性评价及冷胁迫基因差异表达研究

作者：武艳陕西师范大学

学位级别：硕士

茶树[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze],属山茶科山茶属,系亚热带多年生常绿植物,原产于我国西南地区、缅甸北部和印度阿萨姆一带。茶树是我国重要的经济作物,茶也是日常生活中的重要饮品。近年来茶叶需求量增加,茶树种植区域北移,但... 详细信息

茶树[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze],属山茶科山茶属,系亚热带多年生常绿植物,原产于我国西南地区、缅甸北部和印度阿萨姆一带。茶树是我国重要的经济作物,茶也是日常生活中的重要饮品。近年来茶叶需求量增加,茶树种植区域北移,但茶树喜温畏寒的特性使得一些南方优良种质向北方茶区引种栽培时受年平均温度的制约,越冬困难。我国大部分茶区严冬季节都曾遭受过冻害,导致茶树大幅减产。陕西省是我国茶树适宜生长区的最北缘,种茶产茶历史悠久,茶树资源分布广泛。目前茶树品种主要有紫阳群体、西乡大河坝群体等7大群体28个品种,还有部分稀有单株,如紫阳1号、西乡鸳鸯池大茶树等。在长期繁衍和进化过程中,气候和环境的变迁必定会产生许多品质独特的茶树种质资源,形成丰富的遗传多样性。陕南茶区属于江北茶区,纬度相对较高,年平均气温较南方茶区更低。陕南地方茶树种质在长期适应低温的过程中,极有可能逐步形成对冷胁迫耐受的形态和生理生化特征,所以具备一定的抗寒性应当是陕西地方茶树种质独有的优良特性之一。因此,科学地研究和评价陕西茶树的抗寒性及抗寒机制,对合理开发和利用我省茶树种质资源、选育和改良抗寒种质,对提高陕南茶区的茶树产量和品质都具有十分重要的理论和实践意义。本研究采用陕西地方茶树种质和外地引进的优良茶树种质为材料,通过测定电解质外渗率、SOD活性、CAT活性及可溶性蛋白质含量四个生理生化指标评价陕西茶树种质资源抗寒性;进一步采用mRNA差异显示技术对陕西茶树中具有优良抗寒性的种质在冷胁迫条件下的基因差异表达进行分析,并通过半定量RT-pcr研究了差异表达基因的表达特性。得到的主要结论如下： 1.通过4个生理生化指标的测定,利用主成分分析法结合隶属函数值法,综合评价了23个陕西地方茶树品种、6个外地引进品种共29份茶树种质资源的抗寒性。以抗寒性综合评价值D反映各品种综合抗寒能力,D值越大抗寒性越强,范围为0.201-0.933。根据D值大小对各茶树种质资源抗寒性由强到弱依次排序,其中西乡大河6号D值最大为0.933,抗寒性最强;四川南江种D值最小,仅为0.201,抗寒性最差;其他材料抗寒性介于两者之间。 2.通过聚类分析将29个茶树种质的抗寒性分为3类：西乡大河6号、紫阳圆叶种、西乡大河8号、日本薮北种、平利三阳种、龙井43属强抗寒型;西乡大河5号、西乡大河4号、甘肃大茶树、岚皋大叶泡等共18个种质属中度抗寒型;西乡大河10号、紫阳大柳叶、紫阳1号、福鼎大白茶、四川南江种属弱抗寒型。 3.在所有供试茶树种质中,西乡大河6号CAT活性均较高,紫阳圆叶可溶性蛋白含量较高,西乡大河8号-10℃处理后电解质外渗率较低,以上三个茶树品种均原产于陕西省秦巴山区。弱抗寒性类型中,抗寒性最差的两个品种分别是福鼎大白茶和四川南江种。以上结果说明,西乡大河6号、紫阳圆叶种、西乡大河8号等材料具有较南方引进品种更为优良的抗寒性,是陕西省特有的抗寒性茶树种质。 4.以抗寒性较强的紫阳圆叶种为材料,利用ddrt-pcr获得冷胁迫下差异表达的cDNA片段15个,经二次pcr扩增及假阳性鉴定,最终获得3个与冷胁迫相关的片段,分别为DF-2(B0329/B0305), DF-3(B0329/B0305)和DF-8(B0329/B0311)。 5.根据测序结果和同源性比对分析得出,Csgsf(DF-8)为茶树谷氨酰胺合成酶基因片段,半定量RT-pcr分析表明,在冷胁迫过程中Csgsf的表达量随冷胁迫逐渐减少,为负调控基因片段;Cscaf2(DF-3)是茶树对干旱、低温胁迫均表现应答的基因的片段;Cscafl (DF-2)长度为281bp,表达水平随冷胁迫逐渐减小。 6.建立了适于茶树总RNA提取的SDS-酸酚法。研磨时加入不溶性PVP,提取液中同时加入了PVP和β-巯基乙醇,使得多酚物质在β-巯基乙醇提供的还原环境下不易被氧化;上清液中加入1/3体积5mol/LNaAc(pH4.8)以有效沉淀多糖。该方法提取的总RNA质量高、完整性好,28S rRNA亮度约为18SrRNA的2倍,A260/A280在1.9-2.0之间,A260/A230大于2.0,可用于进一步的分子生物学分析。 7.在茶树抗寒性综合评价中,利用主成分分析法将原有的4个理化指标合并为2个独立的综合指标,其累计贡献率达到82.808%,用于茶树抗寒性综合评价时更为直观、全面,结果更准确,可信度更高。再结合植物抗性评价常用的隶属函数值法得到不同茶树品种抗寒性综合评价值D,D值这一无量纲的纯数使得各茶树品种之间的抗寒性差异具可比性。分析结果表明,选择多个生理生化指标,采用主成分分析结合模糊隶属值法,较好地揭示了指标性状与抗寒性的关系。

关键词：陕西茶树种质抗寒性冷胁迫基因表达差异 ddrt-pcr

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茶树花发育相关基因的差异表达研究

茶树花发育相关基因的差异表达研究

作者：王梦娜陕西师范大学

学位级别：硕士

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)为被子植物门,双子叶植物纲,杜鹃花目,山茶科,山茶属的多年生木本常绿植物。起源于中国,原产于我国四川、云南、贵州等地和印度阿萨姆一带,是我国重要的叶用经济林木之一。茶树从花芽形成到种子的... 详细信息

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)为被子植物门,双子叶植物纲,杜鹃花目,山茶科,山茶属的多年生木本常绿植物。起源于中国,原产于我国四川、云南、贵州等地和印度阿萨姆一带,是我国重要的叶用经济林木之一。茶树从花芽形成到种子的成熟大约需要一年半的时间,在这期间茶树的营养生长和生殖生长同时进行,也会同时吸收机体的营养物质,因此茶树旺盛的生殖生长必定会抑制营养生长,从而影响茶树芽叶的产量和品质,降低经济效益。因此,抑制茶树的生殖生长,促进营养生长,提高茶树芽叶的产量和质量,对提高茶产业经济效益和社会效益具有重要理论和实践意义。陕西茶区地处秦巴山区,地理位置独特,生态条件优异,终年气候温暖湿润,雨量充足,年平均气温适宜,在长期繁衍和进化过程中产生了独特的生物学特性和遗传多样性丰富的茶树种质资源。1981-1984年陕西省进行了茶树种质资源品种的调查,将陕西茶树种质资源分为紫阳群体、西乡大河坝群体、南郑碑坝群体、白河歌风群体、宁强广坪群体、苦茶群体、山阳漫山群体在内的7大群体28个品种,还有部分稀有品种,如紫阳1号、城固县高北村梨树坪的大茶树等。这些类型丰富的茶树资源,为开展茶树花发育的研究提供了有利的条件。以往对茶树的研究多集中于茶树生化成分、适制性、抗逆性等方面,也有学者在茶树花形态结构及花发育过程等方面做了解剖学研究,但对茶树生殖生长相关基因的研究报道较为少见,目前也未克隆到与茶树花发育直接相关的基因。为了能更深入地对茶树花发育的分子机制进行研究,抑制茶树生殖生长,促进营养生长,提高茶树芽叶的质量和产量提供理论和现实依据,因此,有必要对茶树花发育过程中特异表达的基因进行克隆研究。本论文以陕西紫阳群体种的代表性种质紫阳槠叶种为材料,采用改良的SDS-酸酚法提取茶树芽叶和花器官总RNA,进一步通过mRNA差异显示技术分析了茶树花发育过程中基因的差异表达,利用生物信息学检索对差异表达基因的功能加以确定,并结合半定量RT-pcr对差异表达基因进行了表达特性的研究。本研究获得的主要结果如下： 1.采用改良SDS-酸酚法分别提取茶树鲜叶、冻叶和干叶的总RNA,在研磨时加入了不溶性的PVPP;在提取缓冲液中加入了PVP和β-巯基乙醇;在匀浆缓冲液中未用水饱和酚进行抽提,而是加入了pH为4.8的NaAc。用以上改良步骤来防止多酚类物质和多糖类物质对总RNA提取的阻碍,有效降低了总RNA的损失。结果表明,改良的SDS-酸酚法不但能从茶树鲜叶也能够从冻叶和干叶中提取到纯度好、质量高的总RNA。28S rRNA亮度约为18S rRNA的2倍,A260/A280在1.8-2.0之间,可用于本研究中茶树芽叶和花芽发育不同阶段的总RNA提取及进一步的分子生物学分析。 2.采用mRNA差异显示技术研究陕西地方茶树的代表性种质紫阳槠叶种在芽叶和花芽分化发育过程中的6个不同阶段,克隆与花发育相关基因的差异表达cDNA。共获得了差异表达片段27个,其中在花芽形成和发育过程中表达量增加的片段共12条,表达量降低的片段共15条,说明在茶树花芽形成和发育过程中确实存在大量相关基因的差异表达。 3.经二次pcr扩增和RT-pcr分析,最终获得了与茶树花发育相关的差异表达cDNA片段3个,分别是：DF-1(B0328/B0304)、DF-4(B0329/B0303)和DF-14(B0329/B0306)。测序结果显示长度分别为：321bp,329bp和242bp。 4.测序结果经Blast-X同源性比对和半定量RT-pcr分析表明,DF-1与多种植物的精氨酸酶基因有高度同源性,是茶树精氨酸酶基因的cDNA片段,命名为Csaf。在芽叶和花芽分化发育过程中,Csaf为下调表达片段;DF-4和DF-14未检测出同源序列,所以推测可能是未知基因,分别命名为Csfdf1和Csfdf2,其编码的蛋白质可能与茶树花发育有关,但具体功能未知。

关键词：茶树花发育基因差异表达 ddrt-pcr

小尾寒羊无角性状的DNA标记及其差异表达基因的筛选研究

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小尾寒羊无角性状的DNA标记及其差异表达基因的筛选研究

作者：楚康康河北农业大学

学位级别：硕士

培育无角羊品种在养羊生产中具有很多的优势。无角羊不易破坏围栏,在舍饲时占舍面积相对少,且也减少了角生长所需的营养,同时减少角斗伤残的损失,无角羊较有角羊便于管理。在澳大利亚已培育成无角陶赛特羊优良品种,无角羊已成为羊品种... 详细信息

培育无角羊品种在养羊生产中具有很多的优势。无角羊不易破坏围栏,在舍饲时占舍面积相对少,且也减少了角生长所需的营养,同时减少角斗伤残的损失,无角羊较有角羊便于管理。在澳大利亚已培育成无角陶赛特羊优良品种,无角羊已成为羊品种的发展趋势。所以,培育无角绵羊品种对畜牧业发展具有很大的意义。本实验通过分子生物学方法寻找与绵羊角相关的基因,为今后培育无角绵羊品种提供理论依据。其研究结果如下:1、微卫星标记的研究:实验以河北小尾寒羊、无角道赛特、杂种蒙古羊三个品种不同角型的羊为样本,对微卫星位点AGLA226进行扩增检测。实验共找出8个等位基因（A:190bp、B:166bp、C:184bp、D:160bp、E:180bp、F:156bp、G:175bp、H:152bp）,4种基因型AB、CD、EF、GH。通过SPSS软件对实验结果进行独立性卡方检验,结果表明角型与微卫星AGLA226的关联性差异不显著（P>0.05）。2、SNPs分析:本研究利用pcr-SSCP的技术,以牛SYNJ1基因序列为引物,以三个牛品种（有角荷斯坦奶牛、无角安格斯、无角海福特牛）以及无角河北小尾寒羊、无角道赛特、杂种蒙古羊三个品种不同角型的羊DNA为模版,对SYNJ1基因进行SSCP分析及pcr产物测序。结果表明:在SNP bSYNJ13981T位点上未发现多态性及与角性状相关的SNP,在牛羊物种间只存在一个C-T核苷酸差异。3、ddrt-pcr的研究:实验以有角和无角绵羊各3只为样本,分别提取总RNA。根据表型组成有角RNA池和无角RNA池。反转录后两角型的cDNA进行ddrt-pcr分析,共筛选出30条差异片段,经过二次扩增、克隆测序等方法剔除假阳性后,剩余7条差异片段。以该7条片段的测序结果设计引物,再以原RNA反转录的cDNA为模板进行扩增再进一步剔除假阳性片段,最后剩余一条差异片段S1-162。经生物信息学分析,在GenBank里分析发现该片段序列与绵羊的keratin 83（角蛋白83）的mRNA序列（1687-1842bp,非翻译区）具有100%的同源性,与牛的keratin 83的mRNA序列（1690-1835bp,非翻译区）有93%的同源性;对keratin 83的氨基酸序列进行分析,keratin 83可能通过产生异质二聚体进而形成稳定的有活性的四聚体,以及其本身的卷曲螺旋结构对角的有无起到调控作用。该基因可能是无角基因的上游调控基因,其机制有待进一步深入研究。

关键词：小尾寒羊无角基因 pcr-SSCP ddrt-pcr 基因差异表达