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利用ddRT-PCR鉴定芸芥自交不亲和系与自交亲和系的差异表达cDNA（英文）

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华北农学报 2016年第3期31卷 44-50页

作者：范惠玲白生文李华清孙万仓河西学院农业与生物技术学院甘肃张掖734000 甘肃农业大学农学院甘肃兰州730070

芸芥与芸薹属植物具有亲缘关系，也是芸薹属植物的重要育种资源。自交亲和性是芸芥的一种重要变异性状。为了探明芸芥自交亲和基因的表达器官，并分离与自交亲和性有关的WNA片段，以芸芥的一对近等基因系，自交亲和系（SC)与自交不亲和... 详细信息

芸芥与芸薹属植物具有亲缘关系，也是芸薹属植物的重要育种资源。自交亲和性是芸芥的一种重要变异性状。为了探明芸芥自交亲和基因的表达器官，并分离与自交亲和性有关的WNA片段，以芸芥的一对近等基因系，自交亲和系（SC)与自交不亲和系（SI)为试材，利用差异显示RT-pcr技术分别对开花前和开花后的叶片、花药和柱头进行鉴定。结果表明，不论开花前还是开花后，芸芥自交亲和系与自交不亲和系的叶片或花药间的扩增带型是一样的，但在近等基因系的柱头间得到了差异表达条带。这证明芸芥自交亲和基因不是组成型表达，而是组织特异性表达，柱头是其唯一的表达器官。在开花前的自交亲和系中共得到了2条cDNA片段，一条小于100bp，另一条为750～1000bP，在开花后的自交亲和系中得到了1条300bp的cDNA片段。据分析这3条cDNA片段可能与芸芥的自交亲和性密切相关。在开花前的自交不亲和系中共得到了2条cDNA片段，一条为500bp，另一条为750bp，同时在开花后的自交不亲和系中得到了1条500～600bp的cDNA片段。这些cDNA片段可以用来区分芸芥的自交亲和系与自交不亲和系，还可用于克隆自交亲和基因。

关键词：芸芥自交亲和系自交不亲和系 ddRT-PCR

ddRT-PCR技术分析甜菜盐胁迫下相关基因差异表达

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DDRT-PCR技术分析甜菜盐胁迫下相关基因差异表达

作者：李鹤男哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

影响作物产量的因素众多，其中主要问题之一是土壤盐渍化，并且土壤盐渍化目前有明显的严重和扩大趋势。甜菜在全世界很多地区均有种植，是重要的产糖经济作物。相对于其他作物，甜菜具有较好的耐盐碱性。研究甜菜耐盐性，进一步从分子... 详细信息

影响作物产量的因素众多，其中主要问题之一是土壤盐渍化，并且土壤盐渍化目前有明显的严重和扩大趋势。甜菜在全世界很多地区均有种植，是重要的产糖经济作物。相对于其他作物，甜菜具有较好的耐盐碱性。研究甜菜耐盐性，进一步从分子水平上认识甜菜耐盐碱机理，发现并得到更多的甜菜耐盐基因，有利于对于提高栽培甜菜及其他植物的耐盐性、丰富耐盐基因资源意义重大。本研究以耐盐甜菜品系“O”68为材料，经高盐（300mM浓度NaCl）处理后利用改进的ddRT-PCR技术和银染技术对在正常条件下与高盐条件下甜菜叶片进行不同处理条件下的mRNA差异显示分析，以期找到有价值的耐盐相关基因，并对这些差异表达的cDNA片段进行克隆、测序和功能鉴定。为得到甜菜高盐诱导表达的基因片段，利用RNA提取试剂盒提取处理组和对照组叶片总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测完整性并利用分光光度计检测RNA样品的纯度后，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，利用26条随机引物与3条锚定引物Oligo（dT）10G（C或A）组合成78对引物组合进行pcr扩增。pcr扩增产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并采取银染法显色。共获得扩增条带一千余条，差异条带50条，其中上调15条，下调35条，选取差异片段回收并进行二次扩增，对回收的片段利用Northern杂交验证，阳性结果进行克隆、测序、NCBI上比对以及同源性分析，本研究共获得12条耐盐相关cDNA片段，涉及叶绿体mRNA及tRNA、SOS信号通路蛋白cDNA、NADH脱氢酶cDNA、硫铁蛋白cDNA等。并由以上结果推测高盐胁迫导致甜菜叶绿体及其相关蛋白转录增强，金属硫蛋白表达增强，盐敏感的信号通路（如SOS）及相关蛋白等在高盐条件下随之表达发生改变。

关键词：甜菜盐胁迫 ddRT-PCR mRNA差异显示分析

ddRT-PCR法研究小鼠耐受全氟异丁烯中毒的相关基因

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卫生研究 2005年第2期34卷 143-145页

作者：唐治华荣曙丁树标南京军区联勤部军事医学研究所南京210002

目的　急性低剂量全氟异丁烯 (PFIB)染毒后的活存小鼠可对致死量PFIB产生耐受性 ,本文旨在寻找与耐受有关的基因对揭示PFIB中毒耐受机制。方法　采用静式全暴露法 3次染毒PFIB ,抽提耐受 1个致死量PFIB活存动物的肺组织tRNA ,采用ddrt- ... 详细信息

目的　急性低剂量全氟异丁烯 (PFIB)染毒后的活存小鼠可对致死量PFIB产生耐受性 ,本文旨在寻找与耐受有关的基因对揭示PFIB中毒耐受机制。方法　采用静式全暴露法 3次染毒PFIB ,抽提耐受 1个致死量PFIB活存动物的肺组织tRNA ,采用ddrt- pcr方法 ,使用 3个锚定引物和 4个随机引物分别对耐受小鼠和对照小鼠肺组织总tRNA进行逆转录和pcr扩增反应 ,通过测序胶电泳和银染分析其基因表达差异 ,并对差异DNA片段进行克隆、测序。结果　耐受PFIB的小鼠与对照鼠相比 ,在基因表达上发生了明显变化。对耐受小鼠特有的 3个差异DNA片段进行克隆、测序 ,通过BLAST与Genbank中的基因比对显示 ,克隆的EST(expressedsequencetags)均与小鼠特定的基因高度同源。结论　特异基因的表达是小鼠耐受PFIB的基础 ,耐受动物特有的 3种差异表达EST对应的基因对于揭示PFIB耐受机理可能具有重要意义。

关键词：全氟异丁烯 ddRT-PCR 肺损伤

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萝卜ddRT-PCR技术体系的优化

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2008年第4期36卷 128-134页

作者：贾晋张鲁刚西北农林科技大学园艺学院陕西省农业分子生物学重点实验室陕西杨凌712100

【目的】探索快速高效的RNA提取方法,建立高效率的mRNA差异显示体系。【方法】以萝卜幼嫩薹叶及花蕾为材料,比较了酸性酚-异硫氰酸胍-氯仿提取法（异硫氰酸胍法）与BIOZOL试剂法提取RNA的效果,并对ddRT-PCR体系中Taq酶、Mg^2＋、dNTPs... 详细信息

【目的】探索快速高效的RNA提取方法,建立高效率的mRNA差异显示体系。【方法】以萝卜幼嫩薹叶及花蕾为材料,比较了酸性酚-异硫氰酸胍-氯仿提取法（异硫氰酸胍法）与BIOZOL试剂法提取RNA的效果,并对ddRT-PCR体系中Taq酶、Mg^2＋、dNTPs、引物及cDNA用量进行了优化。【结果】BIOZOL试剂提取的RNA量大质好,经纯化后,其OD260/OD280值为1.8-2.1,表明杂质少,质量浓度大于1μg/μL,符合mRNA差异显示的要求；确定的最佳ddRT-PCR反应体系（20μL）为：10×Buffer 2.5 mmol/L,Mg^2＋2.8 mmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,Taq酶1.5 U,锚定引物2.5μmol/L,随机引物1.25μmol/L,cDNA用量0.5μL。mRNA差异显示结果表明,高分辨率的片断为100-1 000 bp。经验证,该体系也适用于大白菜和油菜mRNA差异显示研究。【结论】通过两种RNA提取方法比较和ddRT-PCR体系优化,获得了萝卜最佳RNA提取方法及mRNA差异显示反应体系。

关键词：萝卜 RNA提取 ddRT-PCR 体系优化

基于ddRT-PCR法的籽粒苋在镉胁迫下基因差异表达分析

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基于DDRT-PCR法的籽粒苋在镉胁迫下基因差异表达分析

作者：胡洪利四川农业大学

学位级别：硕士

籽粒苋（Amaranthus hypochondriacus）是粮、饲、肥菜兼用型的优质、高产、高效的多功能作物,也是一种很有开发价值的生物钾源。工业生产活动使地球上的部分土壤被重金属污染,这已成为深受全球关注的环境问题,而镉（Cd）是被列为我国... 详细信息

籽粒苋（Amaranthus hypochondriacus）是粮、饲、肥菜兼用型的优质、高产、高效的多功能作物,也是一种很有开发价值的生物钾源。工业生产活动使地球上的部分土壤被重金属污染,这已成为深受全球关注的环境问题,而镉（Cd）是被列为我国优先控制污染的8种重金属元素之一。植物修复技术是目前经济有效的重金属污染土壤修复方法之一,能富集和耐受Cd的籽粒苋成为应用此技术进行Cd污染防治的关注热点。本研究首次将技术成熟的差异显示pcr技术应用于籽粒苋Cd胁迫环境下的差异表达基因的筛选。本实验意图将在Cd胁迫环境下有表达变化的基因片段作为以后籽粒苋富集和耐受Cd的机理研究的基础,对Cd污染防治做出一定的贡献。通过实验得到了以下结果：1.籽粒苋储存材料RNA提取效果优于鲜样,而籽粒苋叶、根、果部位的RNA提取效果均优于茎部位的RNA提取效果。2.通过均匀设计法对ddRT-PCR的pcr体系的优化结果显示,Mix体系pcr优化条件为：cDNA 1μL,退火温度40.8℃,35个循环。酶体系pcr优化条件为：cDNA 1.5μL, dNTP 2 μL, Mg2+1 μL, Taq酶2 μL,退火温度为45℃,45个循环。3.通过引物筛选,确定了进行研究所需的引物组合：适用于叶部位材料的5条引物（RP18、RP19、RP20、RP23、RP24）与AP1、AP2、AP3的引物组合,以及适用于根和果部位的7条引物（RP8、RP14、RP18、RP19、RP20、RP23、RP24）与AP1、AP2、AP3的引物组合。将籽粒苋的根、果、叶三个部位的材料分为对照组和处理组（Cd胁迫）进行实验,电泳结果显示,处理组与对照组的基因表达存在上调表达、下调表达、常量表达三种表达量变化。籽粒苋Cd胁迫下DNA聚合酶Ⅲ基因表达呈上调表达变化,而SSA基因、假定蛋白MTR、β-葡萄糖苷酶基因呈下调表达。推测是由于Cd胁迫导致机体遗传物质代谢受损,DNA聚合酶Ⅲ表达量上升,植物机体遗传分子复制机制机制更加活跃,弥补胁迫带来的损伤。而SSA蛋白的表达下降,植物有衰老迹象,但同时诱发了ACC合成酶和ACC氧化酶的表达量的同步降低,直接有效抑制乙烯的生物合成,延缓成熟,抵御植物Cd胁迫带来的生物活性的降低和衰退。假定蛋白MTR表达量下降,通过叶酸调节细胞物质代谢。而β-葡萄糖苷酶表达量降低,影响ABA的表达量,从而调节植物体的生长代谢水平。

关键词：籽粒苋 Cd胁迫 ddRT-PCR

利用ddRT-PCR分析茶树冬季冷驯化过程中基因表达的差异

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热带作物学报 2011年第4期32卷 648-652页

作者：梅菊芬汤茶琴徐德良王新超江苏省茶叶研究所江苏无锡214063 中国农业科学院茶叶研究所国家茶树改良中心浙江杭州310008

采用ddRT-PCR方法对茶树冬季冷驯化过程中3个样品基因差异表达进行初步研究。结果表明,抗寒性不同的茶树存在基因差异表达。从134条差异片段得到稳定扩增的差异片段31条。根据差异片段的序列设计引物对部分片段进行RT-pcr鉴定假阳性,得... 详细信息

采用ddRT-PCR方法对茶树冬季冷驯化过程中3个样品基因差异表达进行初步研究。结果表明,抗寒性不同的茶树存在基因差异表达。从134条差异片段得到稳定扩增的差异片段31条。根据差异片段的序列设计引物对部分片段进行RT-pcr鉴定假阳性,得到10个阳性片段,其中6个表达量增加,4个表达量降低。经过BLAST比对分析,这些基因与多种植物基因同源性较高,如nectainⅢ蛋白基因(3)、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶蛋白家族基因(48)、微管蛋白特异性C伴侣基因(52)、光合系统Ⅱ蛋白D1基因(80、138)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(147),15、82、134和葡萄的蛋白同源性较高。72经比对没有同源性序列。

关键词：茶树冷驯化基因表达差异 ddRT-PCR

利用ddRT-PCR技术研究AM真菌侵染紫穗槐过程中相关基因

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利用DDRT-PCR技术研究AM真菌侵染紫穗槐过程中相关基因

作者：张星星黑龙江大学

学位级别：硕士

丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza,AM）是一种广泛存在的内生菌根,能增强植物对矿质营养元素（尤其是磷元素）和水分的吸收,减缓干旱危害和保持土壤结构,促进植物的生长。AM共生过程是一个多方面参与并精细协调的信号事件,共生体系中的... 详细信息

丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza,AM）是一种广泛存在的内生菌根,能增强植物对矿质营养元素（尤其是磷元素）和水分的吸收,减缓干旱危害和保持土壤结构,促进植物的生长。AM共生过程是一个多方面参与并精细协调的信号事件,共生体系中的双方相互识别并发生一系列复杂的形态学和生理学变化。本实验选用木本豆科植物代表树种紫穗槐（Amorpha fruticosa）及AMF摩西球囊霉（Glomus mosseae）,利用mRNA差异显示技术研究丛枝菌根共生建立过程中的信号识别相关基因,从分子水平上对菌根共生机制、信号转导途径进行深入研究。该研究结果对丰富和发展共生生态学具有重要的理论意义,为更好地利用固氮树种资源、菌根技术和提高共生固氮的效率都将产生重要的现实意义。首先,选取三种总RNA提取的方法:Biozol法、SDS/酚法、CTAB法,对侵染率分别为0%、10%、30%、50%、100%的接种AMF（arbuscular mycorrhizal fungi,AMF）与接种灭活的AMF对照处理的紫穗槐根部提取总RNA,通过测定其吸光度值计算其纯度和1.1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整度,结果表明,在五个不同侵染率,均为Biozol法提取的总RNA纯度高,质量好,且提取时间较短仅需2-3h。将效果较好的Biozol方法提取的侵染率为0%（前期）和30%（后期）的总RNA进行纯化并反转录成cDNA。其次,用20条随机引物和3条锚定引物扩增cDNA,pcr产物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。本试验共获得了169条差异显示的表达片段,前期为63条,后期106条。对169条中的30条进行反Northern杂交验证。经过统计,前期的差异片段阳性率为42%,而后期的假阳性率较高为61%,共得到12条阳性差异片段。最后,对阳性差异条带进行克隆测序,大部分为250-500bp左右。并且已经提交NCBI上的EST库,其在GenBank上的序列号为:GW317173,GW327914,GW327915,GW327873,GW327874,GW327875,GW327876, GW327877,GW327878, GW327879 ,GW327880 ,GW327881。同时,对12条差异片段进行Blastx比对分析,其中,DD-1与蓖麻属的假定蛋白相似性较高,DD-2与同源域-亮氨酸拉链蛋白有关,调控植物特有的发育进程,以及对包括外界胁迫在内的环境信号的应答;DD-3与ATP结合盒蛋白有关,可以帮助代谢产物、离子、糖、氨基酸、脂类、固醇以及药物等多种底物通过细胞内、外膜;DD-4与阿耶罗菌属和青霉菌属的假定蛋白相似;DD-5与大麦的呼吸氧化酶基因相似,在菌根共生的前期阶段,形成丛枝菌根时,最明显的植物生理变化就是植物的呼吸作用增加;DD-7与黄杆菌属的基因组有较大的相似性;DD-8与乙酰转移酶相关,对蛋白质的稳定性和活性产生重大影响;DD-9与阿耶罗菌属假定蛋白相似性较高;DD-10与苜蓿中核糖核酸酶H相似;DD-11在拟南芥中克隆的转座子基因序列相似;DD-12与色素蛋白有关,而色素蛋白主要是在植物进行光合作用中有重要的作用。其中,DD-6没有相似性高的基因或是相关蛋白基因。

关键词：丛枝菌根信号识别 ddRT-PCR 反Northern杂交生物信息学

抗玉米灰斑病相关基因的ddRT-PCR分析

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东北农业科学 2016年第3期41卷 46-50页

作者：贾娇马莹莹苏前富孟灵敏张伟李红晋齐鸣吉林省农业科学院/农业部东北作物有害生物综合治理重点实验室吉林公主岭136100

为深入了解玉米抗灰斑病的分子机理,本试验以抗/感玉米灰斑病自交系78599-1、OH43Ht N/掖478、K12为试验材料,利用ddRT-PCR方法筛选玉米6叶期时接种玉米灰斑病菌粗毒素0、5、7和9 d时玉米叶片中差异表达的m RNA并通过反式Northern进行... 详细信息

为深入了解玉米抗灰斑病的分子机理,本试验以抗/感玉米灰斑病自交系78599-1、OH43Ht N/掖478、K12为试验材料,利用ddRT-PCR方法筛选玉米6叶期时接种玉米灰斑病菌粗毒素0、5、7和9 d时玉米叶片中差异表达的m RNA并通过反式Northern进行验证。结果发现在抗/感材料78599-1、OH43Ht N/掖478、K12中分别分离到6、5、5和3条差异表达片段;对19条差异表达片段进行测序和blast分析,得到6个候选基因片段,它们与玉米中MTN3、CONSTANS-CO5家族的基因、脱落酸受体基因和酰基辅酶A结合蛋白基因同源性分别为97%、99%、97%和100%;另外获得2个基因片段与未知功能基因同源性均为99%。研究结果将为深入研究抗灰斑病分子机理提供理论依据。

关键词：玉米灰斑病抗性基因 ddRT-PCR 抗/感自交系

当归抽薹植株的生理生化特征及ddRT-PCR分析

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当归抽薹植株的生理生化特征及DDRT-PCR分析

作者：陆则权甘肃农业大学

学位级别：硕士

当归[Angelica sinensis （Oliv.） Diels]为伞形科当归属多年生草本药用植物,具有补血和血、调经止痛、润燥滑肠等功效。甘肃岷山北麓海拔在2000-2800 m的高寒阴湿山区（岷县、宕县、漳县、渭源、宕昌等）是中国当归最集中的产区,平均... 详细信息

当归[Angelica sinensis （Oliv.） Diels]为伞形科当归属多年生草本药用植物,具有补血和血、调经止痛、润燥滑肠等功效。甘肃岷山北麓海拔在2000-2800 m的高寒阴湿山区（岷县、宕县、漳县、渭源、宕昌等）是中国当归最集中的产区,平均每年的种植面积约为20000 hm2,年产量约为6500 t,分别占全国当归栽培总面积、总产量的70%和90%以上,成为当地经济的支柱产业,对贫困地区农民脱贫致富起到了重要作用。但当归生产上存在早期抽薹的问题,一般抽薹发生率达30%～50%,有时可达90%以上,早期抽薹植株完全丧失其药用价值,对生产危害极大。因此,通过对当归抽薹植株的生理生化特征及ddRT-PCR分析,了解当归抽薹过程中所发生的生理生化变化及差异基因表达,为预防当归抽薹提供理论依据。通过分析抽薹与未抽薹当归植株在不同生长发育时期的生理生化特征得出,在抽薹前10 d,未抽薹植株的游离氨基酸、POD活性和PPO活性分别为7.53 mg/（g FW）、0.097ΔA470/ （min·g FW）、0.087ΔA410/（min·g FW）,比抽薹植株低1.3 mg/（g FW）、0.02ΔA470/ （min·g FW）、0.014ΔA410/（min·g FW）,抽薹植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量分别为4.63%和0.94%,比未抽薹植株高2.2%和0.5%。在抽薹期,未抽薹植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量较高,而抽薹植株的游离氨基酸含量、PPO活性和POD活性较高。说明当归抽薹过程是在各种代谢因子调控并进行一系列复杂的生理生化反应的复杂的生理发育过程。通过提取抽薹期抽薹与未抽薹当归植株叶片总RNA,采用ddRT-PCR技术分析抽薹当归差异基因的表达,并对影响ddRT-PCR技术pcr扩增的各种反应参数的优化,最终确立适合于当归pcr扩增体系及扩增程序。对ddRT-PCR技术扩增并回收成功8条差异条带,测序和blast比对分析发现,其中部分基因与白菜（Brassica rapa pekinensi）和紫花地丁（Viola philippica Car）的18SRNA、芜青（B.rapa chloroplast）叶绿体petA基因、拟南芥（Arabidopsis thaliana）mRNA（CID12）基因及与拟南芥花芽分化有关的GSLTFB95ZF12基因相似度高,但这些基因是否与当归抽薹特性相关,还需进一步克隆全序列的cDNA及功能鉴定。

关键词：当归抽薹未抽薹生理生化特性 ddRT-PCR