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dutp焦磷酸酶研究进展

生命的化学 2002年第4期22卷 356-359页

作者：陈巧林任宏伟茹炳根北京大学生命科学学院蛋白质工程国家重点实验室北京100871

dutpase通过催化水解dutp,降低尿嘧啶在DNA中的错误掺入,调节dutp/dTTP的正常比例,保证了DNA复制的正确性和顺利进行。绝大多数dutpase结构相似,活性中心由不同的亚基共同参与。dutpase的活性已确定存在于真核及原核的多种组织中,其在... 详细信息

dutpase通过催化水解dutp,降低尿嘧啶在DNA中的错误掺入,调节dutp/dTTP的正常比例,保证了DNA复制的正确性和顺利进行。绝大多数dutpase结构相似,活性中心由不同的亚基共同参与。dutpase的活性已确定存在于真核及原核的多种组织中,其在细胞内的表达依赖细胞周期或细胞发育的调控。许多病毒也编码dutpase,且与病毒的感染力有关。研究显示该酶的表达对由胸苷酸合成酶(TS)抑制剂产生的细胞毒性具有关键的拮抗作用,为dutpase拮抗剂在癌症化疗和逆转录病毒治疗中的开发应用奠定了理论基础。

关键词： dutp焦磷酸酶研究进展结构调控 TS抑制剂

高温噬菌体TSP4脱氧尿苷焦磷酸酶的克隆表达及其特征

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高温噬菌体TSP4脱氧尿苷焦磷酸酶的克隆表达及其特征

作者：何进昆明理工大学

学位级别：硕士

脱氧尿苷焦磷酸酶(dutpase)是DNA合成中一种重要水解酶,它能水解脱氧尿苷三磷酸(dutp)形成脱氧尿苷单磷酸(dUMP)和无机焦磷酸PPi,防止DNA复制过程中dutp浓度过高而引起错误掺入,从而降低细胞中dutp/dTTP的比例,保证DNA复制的正确性和顺... 详细信息

脱氧尿苷焦磷酸酶(dutpase)是DNA合成中一种重要水解酶,它能水解脱氧尿苷三磷酸(dutp)形成脱氧尿苷单磷酸(dUMP)和无机焦磷酸PPi,防止DNA复制过程中dutp浓度过高而引起错误掺入,从而降低细胞中dutp/dTTP的比例,保证DNA复制的正确性和顺利进行。dutpase作为细胞内dutp水平的主要调节者,已经被用作许多抗癌和抗病毒感染性疾病药物的作用靶子,临床上也已经有了用胸苷酸合成酶抑制剂和二氢叶酸还原酶拮抗剂进行治疗。本文以腾冲热海栖热菌噬菌体TSP4为材料,对高温噬菌体脱氧尿苷焦磷酸酶进行了相关研究。将编码TSP4dutp焦磷酸酶的TSPdutpase基因通过PCR扩增、连接、转化后得到重组表达菌pET-32a-TSPdutpase/Rosetta(DE3),重组蛋白pET-32a-TSPdutpase在16℃、终浓度为1mM IPTG诱导8小时的条件下能大量的表达。使用Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化表达的TSPdutpase,并对其活性,最适作用温度、pH、底物特异性以及金属离子对其活性的影响进行分析。结果表明,它的最适催化温度和pH分别为65℃和7.5,最佳催化底物为dutp, Mg2+对dutpase的活性非常重要,而且如果没有Mg2+的参与,脱氧尿苷焦磷酸酶dutpase则不能显示其活性。同时发现EDTA能够抑制脱氧尿苷焦磷酸酶dutpase的活性,它能够与Mg2+竞争的和脱氧尿苷焦磷酸酶dutpase相结合,从而使其酶活降低。为了检测重组蛋白TSPdutpase在不同温度下热稳定性和酶活变化,本文采用ANS荧光探针法检测其在不同温度下结构的变化,结果表明TSPdutpase在65℃以下比较稳定,在75℃下处理半小时酶活会下降到一半左右,在80℃下会没有酶活。为了探索分子伴侣TSPcpn47对重组蛋白TSPdutpase热稳定性的影响,本文将同样从噬菌体TSP4基因组中克隆表达出的分子伴侣TSPcpn47与TSPdutpase进行相互作用,结果发现,在两者共存的条件下,dutp焦磷酸酶的热稳定性有了很大的提升,证明了分子伴侣TSPcpn47能提高蛋白质热稳定性,这表明分子伴侣可能与嗜热菌能够生存在极端高温的环境相关。本实验对进一步深入研究高温噬菌体的耐热抗逆的分子机制奠定了良好的基础。

关键词：噬菌体TSP4 dutp焦磷酸酶 ANS 分子伴侣热稳定性

急性病毒性坏死病毒dutpase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

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水产学报 2011年第9期35卷 1320-1326页

作者：贾志磊王崇明任伟成梁彦韬曲朋李赟中国海洋大学教育部海水养殖重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所哥德堡大学

根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dutpase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,... 详细信息

根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dutpase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建表达质粒pET32a-dut。然后,将其转化至*** BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46 ku,与预期表达蛋白大小一致。经Western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dutpase。表达产物经Co2+柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dutpase能特异性催化dutp,EDTA可以抑制dutpase的活性,而Mg2+可以增强其活性。

关键词：栉孔扇贝 dutp焦磷酸酶急性病毒性坏死病毒原核表达酶学活性

人细胞核dutpase的克隆表达及其酶学活性

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中国生物化学与分子生物学报 2003年第5期19卷 606-611页

作者：陈巧林任宏伟康巧华王宗元茹炳根扬州大学畜牧兽医学院扬州225009 北京大学生命科学学院生物化学与分子生物学系

以阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)患者脑cDNA文库质粒为模板 ,用PCR方法扩增得到人细胞核dutp焦磷酸酶 (dutpase)的cDNA ,将其克隆到谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 4T 1中 ,并在大肠杆菌BL2 1中获得高效表达 .表... 详细信息

以阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)患者脑cDNA文库质粒为模板 ,用PCR方法扩增得到人细胞核dutp焦磷酸酶 (dutpase)的cDNA ,将其克隆到谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 4T 1中 ,并在大肠杆菌BL2 1中获得高效表达 .表达的融合蛋白GST dutpase经过谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,凝血酶酶切和SephacrylS 10 0纯化 ,得到高纯度dutpase蛋白 .通过SDS PAGE ,氨基酸组成分析 ,N端氨基酸序列测定以及HPLC测Mr 结果与期望值一致 .通过检测该酶水解dutp释放的焦磷酸 (PPi)来测定表达产物dutpase蛋白及GST dutpase融合蛋白的酶活性 ,发现两蛋白都具有正常的酶水解dutp活性 ,但融合蛋白的活性比dutpase蛋白低 7～ 8倍 .同时研究了Mg2

关键词：人细胞核 dutpase 克隆表达酶学活性 dutp焦磷酸酶亲和层析

猪囊尾蚴dutpase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

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中国农业科学 2010年第1期43卷 192-199页

作者：刘振勇吕志慧郑亚东窦永喜乔军骆学农张艳景志忠才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室

【目的】克隆、表达猪囊尾蚴dutpase基因并分析其酶学活性。【方法】通过RT-PCR的方法克隆猪囊尾蚴dutpase基因,将其与pET载体连接并在原核系统中高效表达;表达产物经Ni柱纯化后进行酶学活性测定。【结果】序列分析表明猪囊尾蚴dutpase... 详细信息

【目的】克隆、表达猪囊尾蚴dutpase基因并分析其酶学活性。【方法】通过RT-PCR的方法克隆猪囊尾蚴dutpase基因,将其与pET载体连接并在原核系统中高效表达;表达产物经Ni柱纯化后进行酶学活性测定。【结果】序列分析表明猪囊尾蚴dutpase基因与六钩蚴的dutpase基因核苷酸同源性为100%,而且其氨基酸序列中同样存在5个保守基序。SDS-PAGE显示在21kD附近出现与目的蛋白大小相符的特异条带,表达产物经纯化后dutpase的含量为2.863mg·mL-1。酶学活性试验证实重组dutpase能特异性降解dutp,同时EDTA可以抑制dutpase的活性;而Mg2+可以增强猪囊尾蚴dutpase的活性。【结论】成功克隆表达了猪囊尾蚴dutpase基因并鉴定了它的酶学活性,为进一步研究dutpase在猪囊尾蚴中的生物学功能奠定了基础,同时也为抗猪囊尾蚴病的药物设计和开发提供了研究基础。

关键词： dutp焦磷酸酶猪囊尾蚴原核表达酶学活性

急性病毒性坏死病毒dutpase基因的克隆及表达分析

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急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆及表达分析

作者：贾志磊中国海洋大学

学位级别：硕士

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北方沿海重要的养殖经济贝类之一，但自1997年起连续暴发的“大规模死亡症”导致了该产业的巨大损失。近年的研究证实，急性病毒性坏死病毒(Acute virus necrosis virus, AVNV)是其主要的致病病原。该... 详细信息

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北方沿海重要的养殖经济贝类之一，但自1997年起连续暴发的“大规模死亡症”导致了该产业的巨大损失。近年的研究证实，急性病毒性坏死病毒(Acute virus necrosis virus, AVNV)是其主要的致病病原。该病毒为双链DNA病毒，病毒颗粒为具囊膜的二十面体结构，直径大小为130～170nm。2009年,任伟成等完成了AVNV病毒的全基因组测序分析，预测AVNV基因组中含有123个潜在的开放阅读框(open reading frames，ORF)，其中44个ORF具有一定的结构和功能，推测可能与病毒DNA复制、核酸代谢、修饰以及病毒与宿主相互作用等有关。而ORF074推测为编码脱氧尿苷焦磷酸酶(dutp pyrophosphatase, dutpase)的基因，主要与病毒DNA复制有关(任伟成等，2009)。脱氧尿苷焦磷酸酶(dutp pyrophosphatase, dutpase)是一种生物界普遍存在的重要水解酶，它与DNA复制和病毒毒力密切相关。为确定ORF074是否编码特定的具有功能的酶或蛋白，以及编码蛋白在AVNV感染、复制及AVND暴发中的作用，作者根据栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒ORF074基因序列，构建了dutpase基因的原核表达载体，在***中进行原核表达、纯化并对重组dutpase的酶学活性进行了分析;构建了dutpase基因的真核表达载体pEGFP-N1-dut并在草鱼肾脏细胞(CIK)中进行了真核表达及亚细胞定位分析。此外，对AVNV病毒感染栉孔扇贝不同时间的基因表达进行荧光定量PCR分析，在mRNA水平进行转录和表达时序分析，探讨了基因对病毒在宿主体内复制的影响。另外，为构建AVNV的体外扩增系统，为更深入研究其侵染机制和致病机理提供技术平台，取健康栉孔扇贝的外套膜、血淋巴、鳃、闭壳肌、肾脏等组织进行体外的原代和传代培养，初步研究并建立了栉孔扇贝组织细胞的体外培养技术，为之后的研究提供了有益的探索。 *** dutpase基因的克隆及原核重组表达。根据AVNV基因组序列，设计特异性引物，扩增编码AVNV dutpase的ORF074,经1%琼脂糖凝胶电泳得到一条约750bp大小的条带，双酶切后将其连接至pET32a中构建重组原核表达载体pET32a-dut，并将其转化至感受态细胞BL21(DE3)中，加IPTG至终浓度1mmol/L,诱导4-5小时后，SDS-PAGE电泳,得到一条约45kD的条带，经Western-blot及质谱分析确定为重组dutpase。 2.重组dutpase的纯化及酶学活性分析。利用Co亲和层析柱对表达的重组dutpase进行了纯化并测定了纯化的重组dutpase的比活、底物特异性、不同金属离子及EDTA对其活性的影响等。结果显示：1、重组dutpase具有较强的底物特异性，能特异的催化dutp水解。2、Mg、Ca、Co、Zn等金属离子能增强重组dutpase的催化活性，其中Mg作用效果最显著，依次为Mg> Ca>Co> Zn。3、EDTA能抑制重组dutpase的活性，而Mg、Ca、Co、Zn等金属离子能在一定程度上解除这种抑制作用。 3.利用荧光定量PCR技术完成了AVNV病毒感染栉孔扇贝后，dutpase基因的转录时序分析。分别取感染AVNV病毒0,4,8,12,16,24,36,48h后栉孔扇贝的肝胰腺，提取总RNA，反转录，荧光定量PCR，确定了dutpase基因在不同时间的表达。结果表明：该基因是一种早期基因，在AVNV感染栉孔扇贝4h后即开始表达，16h后达到峰值，之后逐步下降。 4.利用RACE技术确定了dutpase基因的转录起始位点。利用5’RACE技术确定了dutpase基因的转录起始位点。首先用AVNV病毒感染栉孔扇贝，16h后提取肝胰腺的总RNA，随机引物反转录，用末端转移酶加poly(C)尾巴，之后用根据dutpase基因设计的GSP引物及Adaptor(dG)进行PCR扩增，得到一条约250bp的条带，经测序发现其转录起始位点为起始密码子上游第十个核苷酸——胸腺嘧啶脱氧核苷酸。 5.构建了重组真核表达载体pEGFP-N1-dut，并将其转染进草鱼肾脏细胞(CIK)中进行了真核表达及亚细胞定位分析。根据dutpase基因的序列，设计真核表达用的特异性引物，双酶切后将其连接至真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组真核表达载体pEGFP-N1-dut，将重组载体转染至草鱼肾脏细胞(CIK)中，48h后，激光共聚焦显微镜观察其在CIK中的表达。表明重组质粒在CIK细胞的细胞质和细胞核中均有表达。 6.培养得到了栉孔扇贝鳃、肾脏、闭壳肌、外套膜、血淋巴等5种组织的细胞，并进行了传代

关键词： dutp焦磷酸酶栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒原核表达酶学活性真核表达组织培养

TS、TP和dutpase在大肠癌原发灶和相应淋巴结转移灶中表达差异与5-Fu化疗敏感性关系的研究

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中国实用医刊 2014年第23期41卷 4-7页

作者：任建林田林赵素琴梁建芳郑绘霞肖虹山西省汾阳医院 032200 山西医科大学第一医院

目的观察、探讨大肠癌、切缘正常组织及其相应转移淋巴结中氟尿嘧啶类药物代谢酶胸苷酸合成酶（TS）、胸苷磷酸化酶（TP）和dutp焦磷酸酶（dutpase）的表达情况;研究是否存在大肠癌原发灶与相应淋巴结转移灶中TS、TP和dutpase表达水平... 详细信息

目的观察、探讨大肠癌、切缘正常组织及其相应转移淋巴结中氟尿嘧啶类药物代谢酶胸苷酸合成酶（TS）、胸苷磷酸化酶（TP）和dutp焦磷酸酶（dutpase）的表达情况;研究是否存在大肠癌原发灶与相应淋巴结转移灶中TS、TP和dutpase表达水平的差异,以及与5-氟尿嘧啶（5-ru）化疗敏感性的关系;评估TS、TP和dutpase作为5-Fu化疗敏感性判定指标的可行性.方法应用免疫组化方法检测33例大肠癌、切缘正常组织及相应转移淋巴结中TS、TP和dutpase的表达情况.结果 33例大肠癌淋巴结转移灶中TS和dutpase的表达在表达水平、染色范围和染色深度三个方面均高于原发灶,差异有统计学意义（P＜0.05）;大肠癌原发灶和淋巴结转移灶中TP的表达均为高表达,无相关性;大肠癌原发灶与淋巴结转移灶的耐药性不尽一致.结论大肠癌原发灶和淋巴结转移灶之间的TS和dutpase表达水平比较差异有统计学意义,应根据转移灶本身的TS和dutpase的表达水平选择化疗方案.

关键词：大肠癌转移淋巴结化疗药敏性 5-氟尿嘧啶胸苷酸合成酶胸苷磷酸化酶 dutp焦磷酸酶

急性病毒性坏死病毒dutpase基因的鉴定及特征分析

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急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的鉴定及特征分析