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基于CRISPR/Cpf1的胞嘧啶碱基编辑器的优化

基于CRISPR/Cpf1的胞嘧啶碱基编辑器的优化

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作者：连萌安徽大学

学位级别：硕士

近些年以CRISPR/Cas系统为基础发展起来的单碱基编辑器,因其不产生DNA双链断裂、无需外源供体模板、适用于不分裂细胞和编辑效率高等特点,已然成为基因编辑领域的新星,该工具已经被运用到点突变疾病动物模型构建、农作物性状改良、疾病... 详细信息

近些年以CRISPR/Cas系统为基础发展起来的单碱基编辑器,因其不产生DNA双链断裂、无需外源供体模板、适用于不分裂细胞和编辑效率高等特点,已然成为基因编辑领域的新星,该工具已经被运用到点突变疾病动物模型构建、农作物性状改良、疾病基因治疗等方面。现阶段发展较为迅猛的单碱基编辑器是基于Sp Cas9发展而来的,其继承了Sp Cas9识别富含G/C PAM(NGG)的特点,这一定程度上限制了该工具的可靶向范围;另一个属于CRISPR第二类系统V型的Cpf1(也称为Cas12a)由于识别富含T/A PAM(TTTV)也被用来构建相关的碱基编辑系统。将r APOBEC与核酸酶失活的d Lb Cpf1进行融合而成的d Lb Cpf1-BE0拓宽了已有的碱基编辑工具箱,但也存在一些问题,比如很多位点编辑效率低下、对于GC基序中的C编辑无效等,这些问题阻碍着基于Cpf1碱基编辑工具的应用发展。本研究基于现有的以Cpf1为基础的碱基编辑工具效率低下的问题,通过不同策略进行优化以提高其编辑效率。首先,我们替换为胞嘧啶脱氨活性更高的h APOBEC3A构建而成的d Lb Cpf1-h A3A,编辑效率最高可达50%。对于一些d Lb Cpf1-BE0基本无效的位点,d Lb Cpf1-h A3A的编辑效率也可达20%。相较于d Lb Cpf1-BE0来讲,d Lb Cpf1-h A3A的平均编辑效率得到显著提高。由于使用脱氨活性更高的h APOBEC3A,d Lb Cpf1-h A3A的活性窗口也有所拓宽,为C6-C13,这也会导致旁观者效应的发生。我们采用h A3A-Y130F、h A3A-Y132D这两个变体来构建编辑器,其可以在保持编辑效率的同时缩窄活性窗口,为C6-C12。我们还利用另一变体h A3A-N57G构建特异性对TCR(R=A/G)基序中的C进行编辑的d Lb Cpf1-h A3A-N57G,这一编辑器可以大大减少旁观者效应,同时保持较高的精确性。除以上特点之外,无论是AC、CC、GC、TC中任一基序中的C,我们构建的d Lb Cpf1-h A3A系列碱基编辑器都可对其进行高效编辑,这与d Lb Cpf1-BE0对于GC基序中的C无效有很大差别。因此,我们成功构建高效的d Lb Cpf1-h A3A系列碱基编辑器。除替换脱氨酶进行编辑效率提升之外,我们还从染色质的开放程度入手,进一步来提高基于Cpf1碱基编辑器的效率。我们利用d Cas9/sg RNA结合在靶位点双侧可以局部打开染色质结构,进而增加靶向编辑效率。但是对于不同的位点,效率提高有所差异,最高可以提高一倍。我们还对sg RNA是否会造成d Cas9靶向位置造成脱靶进行分析,发现使用长度更短(14-15nt)的dead sg RNA比sg RNA脱靶现象要少很多,几乎检测不到。综上所述,我们对基于Cpf1的胞嘧啶碱基编辑器进行优化,实现了高效的碱基编辑,实现了碱基编辑工具箱的扩充。在本研究中使用h APOBEC3A变体构建的系列碱基编辑器,具有不同的特性,为今后的应用提供更多的选择;通过d Cas9结合邻近位置的策略可以进一步提高编辑效率,为该工具的应用奠定基础。

关键词： CRISPR/Cpf1 hAPOBEC3A 胞嘧啶碱基编辑器 dcas9结合

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