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1,3,4,6-四乙酰基-2-O-(2,4,6-三乙酰基-3-胺甲酰基-α-d-甘露糖基)-β-L-古罗糖合成研究

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1,3,4,6-四乙酰基-2-O-(2,4,6-三乙酰基-3-胺甲酰基-α-D-甘露糖...

作者：刘新桂华东师范大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤已成为威胁人类生命健康最严重的疾病之一。传统抗肿瘤药物具有抗肿瘤谱广、疗效明确等优势而在临床上广泛应用,但由于其选择性太差,传统抗肿瘤药物会产生严重毒副作用。分子靶向药物虽能选择性的靶向杀伤肿瘤细胞,但其在临床... 详细信息

恶性肿瘤已成为威胁人类生命健康最严重的疾病之一。传统抗肿瘤药物具有抗肿瘤谱广、疗效明确等优势而在临床上广泛应用,但由于其选择性太差,传统抗肿瘤药物会产生严重毒副作用。分子靶向药物虽能选择性的靶向杀伤肿瘤细胞,但其在临床上的应用受限于肿瘤细胞耐药性的产生。为解决这些问题,基于“靶向分子-linker-抗癌药”的靶向肿瘤给药系统研究成为研究热点。在众多的靶向分子中,糖类化合物具有水溶性好、稳定性高等优点。近期报道博来霉素二糖具有靶向肿瘤的作用,这使得将博来霉素二糖应用于靶向药物设计成为可能。博来霉素二糖部分为2-0-(3-胺甲酰基-a-d-甘露糖基)-L-古罗糖。已有的博来霉素二糖的合成方法有路线冗长、需要用到剧毒化学试剂等缺陷。本论文建立了博来霉素二糖部分新的合成方法：以d-甘露糖为原料,经Fisher糖苷化、苯亚甲基缩醛保护4,6位羟基等反应,以总收率13%得到3-胺甲酰基-1,2,4,6,-四乙酰基甘露糖,以d-葡萄糖醛酸内酯为原料经丙酮叉保护1,2位羟基、上苄基保护5位羟基等反应,以总收率24%得到1,3,4,6,-四乙酰基-L-古罗糖,两个单糖片段采用三氯乙酰亚氨酸酯法高选择性地构建了α-1,2糖苷键,从而完成了该二糖的合成工作。这为后续的靶向药物设计研究奠定了基础。本论文的关键点是：(1)甘露糖片段的合成中,采用相转移催化的办法在2和3位羟基选择性上苄基保护,避免了剧毒试剂nBu2Sn0的使用;(2)古罗糖片段的合成以d-葡萄糖醛酸内酯为原料,避免了选择性氧化的麻烦;(3)在TBdPS保护基存在下,实现酸性条件下选择性脱除丙酮叉保护。

关键词：博来霉素二糖部分靶向肿瘤 d-甘露糖葡萄糖醛酸内酯 L-古罗糖

d-来苏糖异构酶的性质鉴定与酶法制备甘露糖的研究

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D-来苏糖异构酶的性质鉴定与酶法制备甘露糖的研究

作者：余丽娜江南大学

学位级别：硕士

d-甘露糖是一种己醛醣,具有抗炎症、预防尿路感染、促进肠道益生菌生长等生理作用,同时在许多药物及功能物质的合成过程中也发挥着重要作用。用生物法实现甘露糖的生产是目前研究的热点。d-来苏糖异构酶不仅能催化来苏糖与木酮糖之间的... 详细信息

d-甘露糖是一种己醛醣,具有抗炎症、预防尿路感染、促进肠道益生菌生长等生理作用,同时在许多药物及功能物质的合成过程中也发挥着重要作用。用生物法实现甘露糖的生产是目前研究的热点。d-来苏糖异构酶不仅能催化来苏糖与木酮糖之间的异构化,也能实现果糖与甘露糖之间的转化。本课题实验主要研究了来源于深海耐热微生物Thermosedminibacter oceani的d-来苏糖异构酶,对重组酶的酶学性质及甘露糖生产进行了研究,并尝试构建共表达体系以更为经济的葡萄糖为原料研究共表达体系性质及甘露糖生产。来源于***的d-来苏糖异构酶蛋白结构中含有181个氨基酸残基,在GenBank上的登录号为AdL08607.1,编码该蛋白的基因片段全长546 bp。以pET-22b(+)为载体构建重组质粒,用IPTG诱导来苏糖异构酶在大肠杆菌BL21中的过量表达,通过镍柱亲和层析对目的酶进行纯化。SdS-PAGE电泳图显示蛋白相对分子质量为22 kda,与计算分子量结果一致,凝胶色谱结果显示酶相对分子质量为44 kda左右,推测该酶为二聚体结构。酶学性质测定结果显示来苏糖异构酶最适温度为65oC,最适pH为6.5,最适金属离子为Mn2+,具有非常显著的温度稳定性。以果糖为底物测得其比酶活为5.3±0.1U/mg,Km值、kcat值与kcat/Km值分别为27.3±1.3 mM、1,030±26 min-1、38±1mM-1min-1。在最适条件下以100g/L的果糖为底物,加酶量为4 U/mL,反应2h后甘露糖的生成率为26.8%。Acidothermus cellulolyticus 11B葡萄糖异构酶蛋白结构中含有407个氨基酸残基,在GenBank上的登录号为ABK53836.1,编码该蛋白的基因片段全长1224 bp。以pETduet-1为载体构建含有来苏糖异构酶与葡萄糖异构酶的共表达质粒,用IPTG诱导目的基因在大肠杆菌BL21中的过量表达。SdS-PAGE电泳图显示两种酶蛋白分子量分别为22 kda、42 kda,与计算分子量结果一致。酶学性质测定结果显示共表达体系最适温度为65oC,最适pH为6.5,最适金属离子为Co2+。在最适条件下以100g/L的葡萄糖为底物,菌体浓度为100g/L时,反应2h后甘露糖的生成率为16.4%。

关键词： d-来苏糖异构酶 d-甘露糖酶学性质 d-葡萄糖异构酶共表达

高效液相色谱法快捷测定黄原胶中d-甘露糖含量的探究

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安徽医药 2024年第6期28卷 1109-1111页

作者：何遂庆吴芳丽李爱珍浙江一新制药股份有限公司质量控制部浙江金华321100

目的建立高效液相色谱-示差折光(HPLC-RId)法测定黄原胶中d-甘露糖含量的方法。方法该研究起止时间为2022年6月至2023年3月。选择Phenomenex Rezex RCM-Monosaccharide Ca+(300 mm×7.80 mm,8μm)色谱柱,以双蒸水为流动相,流速:0.4 mL/m... 详细信息

目的建立高效液相色谱-示差折光(HPLC-RId)法测定黄原胶中d-甘露糖含量的方法。方法该研究起止时间为2022年6月至2023年3月。选择Phenomenex Rezex RCM-Monosaccharide Ca+(300 mm×7.80 mm,8μm)色谱柱,以双蒸水为流动相,流速:0.4 mL/min,柱温:75℃,进样量:20μL,检测器为示差折光检测器(RId)。结果色谱图显示d-甘露糖分离度良好,d-甘露糖在20.09~100.46μg范围内与峰面积线性关系良好(r=0.9996),d-甘露糖平均加样回收率为99.10%,相对标准偏差(RSd)为0.81%(n=6),精密度、稳定性、重复性试验的RSd均小于2%。结论所建立的d-甘露糖含量测定方法可靠,操作简便,专属性强,重复性好,适合黄原胶中d-甘露糖的含量测定,为黄原胶食用以及药用产品的进一步开发提供了参考数据。

关键词：黄原胶 d-甘露糖含量测定高效液相色谱质量控制

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d-来苏糖异构酶的酶学性质研究

食品与生物技术学报 2019年第1期38卷 83-92页

作者：黄嘉苇施悦张文立张涛江波沐万孟食品科学与技术国家重点实验室江南大学江苏无锡214122 江南大学协同创新中心江苏无锡214122

为探索d-甘露糖的高效酶法合成途径,作者克隆了来源于Peptococcaceae bacterium 1109的d-来苏糖异构酶基因,将其导入到E. coli BL21(dE3)中进行表达。该酶的最适底物为d-来苏糖,并可以高效催化d-果糖与d-甘露糖之间的差向异构反应。以d... 详细信息

为探索d-甘露糖的高效酶法合成途径,作者克隆了来源于Peptococcaceae bacterium 1109的d-来苏糖异构酶基因,将其导入到E. coli BL21(dE3)中进行表达。该酶的最适底物为d-来苏糖,并可以高效催化d-果糖与d-甘露糖之间的差向异构反应。以d-果糖为底物时,重组表达的d-来苏糖异构酶的比酶活可达2.5 U/mg,该酶的最适pH为7.5,最适温度为70℃,Co^(2+)可以显著提高该酶的活力。在最适条件下以500 g/L的果糖为底物,反应8 h达到平衡,平衡转化率达19.17%,生产d-甘露糖95.85 g/L。

关键词： d-甘露糖 d-来苏糖异构酶生物制备

6-氧-叔丁基二甲基硅基-2,4-二-氧-苯甲酰基-3-氧-对甲氧基苄基-α-d-甘露吡喃糖乙硫苷的合成

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合成化学 2018年第7期26卷 490-493页

作者：张飞周颖钰储悦雷进才杨劲松四川大学华西药学院四川成都610041

以d-甘露糖为原料,通过乙酰化、去乙酰化、苯亚甲基化、硅基化等8步反应合成了6-氧-叔丁基二甲基硅基-2,4-二-氧-苯甲酰基-3-氧-对甲氧基苄基-α-d-甘露吡喃糖乙硫苷,总收率21.7%,其结构经~1H NMR,^(13)C NMR,IR和LC-MS(ESI)确证。

关键词： d-甘露糖 6-氧-叔丁基二甲基硅基-2,4-二-氧-苯甲酰基-3-氧-对甲氧基苄基-α-d-甘露吡喃糖乙硫苷合成

d-来苏糖异构酶的性质鉴定及在单糖生物转化中的应用

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D-来苏糖异构酶的性质鉴定及在单糖生物转化中的应用

作者：黄嘉苇江南大学

学位级别：硕士

d-甘露糖是d-葡萄糖C-2位的差向异构体,也是d-果糖的醛糖异构体。它具有益生元活性,可参与免疫调节,也可作为工业化生产功能性甜味剂甘露醇的原料。L-核糖是d-核糖的对应异构体,是一种稀有糖。作为一种重要的医药中间体,L-核糖可合成具... 详细信息

d-甘露糖是d-葡萄糖C-2位的差向异构体,也是d-果糖的醛糖异构体。它具有益生元活性,可参与免疫调节,也可作为工业化生产功能性甜味剂甘露醇的原料。L-核糖是d-核糖的对应异构体,是一种稀有糖。作为一种重要的医药中间体,L-核糖可合成具有抗人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒和肝炎病毒活性的L-核苷类衍生物。近年来,d-甘露糖和L-核糖的生物合成受到了国内外学者的极大关注。d-来苏糖异构酶(d-Lyxose isomerase,EC 5.***.1.15)是一种醛糖-酮糖异构酶,可催化多种单糖之间的异构化反应,包括d-木酮糖和d-来苏糖,d-果糖和d-甘露糖以及L-核酮糖和L-核糖等。本课题主要研究了来源于嗜热细菌Peptococcus bacterium 1109的d-来苏糖异构酶,并分别构建了d-葡萄糖异构酶和该酶的共表达体系,实现从d-葡萄糖一步法生产d-甘露糖,以及L-阿拉伯糖异构酶和该酶的共表达体系,实现从L-阿拉伯糖一步法生产L-核糖,探索经济制备d-甘露糖和L-核糖的有效途径。来源于*** 1109的编码d-来苏糖异构酶基因片段的GenBank登录号为KLU40859.1,全长543 bp。克隆该片段,并将其连接至pET-22b(+)载体上构建重组质粒,导入*** BL21(dE3)中,加入IPTG诱导酶过量表达,使用镍离子亲和层析分离纯化目的蛋白,SdS-PAGE检测结果显示蛋白分子量约为21 kda,与理论分子量结果相一致。凝胶排阻色谱结果显示蛋白全分子量约为42 kda,推测重组酶为同源二聚体。*** 1109 d-来苏糖异构酶的最适pH为7.5,最适温度为70℃,Co可以显著提高其活力。该酶在70℃和75℃下比较稳定,最适底物为d-来苏糖,对d-果糖,d-甘露糖,L-核糖均有催化活性。以d-果糖为底物时,重组d-来苏糖异构酶的比酶活可达2.5±0.2 U/mg。以500 g/L的果糖为底物,在最适条件下反应8 h达到平衡,得到d-甘露糖96.0 g/L,平衡转化率19.2%。将来源于Acidothermus cellulolyticus的d-葡萄糖异构酶和*** 1109 d-来苏糖异构酶的编码基因分别连接至质粒pCdFduet-1上,构建重组共表达质粒并导入*** BL21(dE3),进行发酵培养。重组共表达细胞可利用d-葡萄糖生产d-果糖和d-甘露糖,体系的最适反应条件为pH 6.0和70℃,最适金属离子为Co,在60℃及以下具有较好的热稳定性。以500 g/L的d-葡萄糖为底物,可得到185.0 g/L的d-果糖和62.6 g/L的d-甘露糖。构建Alicyclobacillus hesperidum L-阿拉伯糖异构酶和*** 1109 d-来苏糖异构酶的共表达体系,研究重组共表达细胞利用L-阿拉伯糖产L-核酮糖和L-核糖的能力。该体系的最适反应条件为pH 6.5和65℃,最适金属离子为Co,50℃时具有一定的热稳定性。以500 g/L的L-阿拉伯糖为底物,可得到85.6 g/L的L-核酮糖和45.9 g/L的L-核糖。

关键词： d-甘露糖 L-核糖 d-来苏糖异构酶酶学性质共表达

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d-来苏糖异构酶的性质鉴定与分子改造研究

D-来苏糖异构酶的性质鉴定与分子改造研究

作者：陈铭江南大学

学位级别：硕士

d-甘露糖是一种功能性糖,具有诸多有益生理功效如益生元功能、降血压等,已被广泛应用于食品、药品、化妆品等行业。传统的提取法和化学法在制备d-甘露糖的过程中会加入大量的有机试剂且对反应条件的要求十分严格,因此,利用生物法制备d-... 详细信息

d-甘露糖是一种功能性糖,具有诸多有益生理功效如益生元功能、降血压等,已被广泛应用于食品、药品、化妆品等行业。传统的提取法和化学法在制备d-甘露糖的过程中会加入大量的有机试剂且对反应条件的要求十分严格,因此,利用生物法制备d-甘露糖成为最近的研究热点,其中研究较多的是通过d-来苏糖异构酶催化d-果糖转化为d-甘露糖。d-来苏糖异构酶(d-LIase)是一种醛酮糖异构酶,有较宽的底物谱,多用于催化d-来苏糖与d-木酮糖以及d-果糖与d-甘露糖之间的转化。本文通过基因挖掘技术来寻找全新的d-来苏糖异构酶,并利用分子改造技术对该酶进行酸性改造,研究了该酶的相关酶学性质以及酸性改造后的美拉德反应程度变化,成功得到了一个耐酸耐高温的d-来苏糖异构酶,使得过程中的美拉德反应程度明显降低。本论文发掘了一株来源于古生热变形菌(Thermoprotei archaeon)的d-LIase(Thar-d-LIase)。结果表明该酶的最适温度为80℃,最适p H为6.5,最适金属离子为0.5 mMNi,对金属离子具有明显的依赖性。该酶具有较好的温度稳定性,在70℃和80℃分别孵育48 h和33 h后仍能维持50%以上的相对酶活,同时测得该酶的T值为88.30℃,为目前所有d-LIase中最高,因此该酶的蛋白结构也具有较高的稳定性。在以d-果糖、d-甘露糖、d-来苏糖、L-核糖作为底物反应时,其米氏常数K分别为:10.1、111.5、76.1、1,427.9 mM,催化效率k/K分别为:14.4、25.2、45.4、19.6 mMmin。同时研究了不同温度下该酶催化不同浓度d-果糖产d-甘露糖的能力,随着温度升高,达到平衡的时间更短,而底物浓度的增高也会产生底物抑制使平衡转化率降低。在80℃条件下,以25 g/L～100 g/L的d-果糖为底物,反应12 h后,d-甘露糖的转化率由23.9%降低至17.1%。由于酸性环境能很好地抑制美拉德反应,本课题通过对Thar-d-LIase进行同源建模,并结合理性设计,利用定点突变技术对其进行弱酸性分子改造,使其最适p H降低的同时提高其在酸性环境下的催化酶活。设计的突变体有:E8K、E9K、E19K、E28K、d37K、d42K、d81K、E82K、K83E、P105K、E119K、E165K、E179K、E182K、E82K/P105K、E82K/E165K和P105K/E165K。最终筛选出一株效果最优的双点突变体E82K/P105K,结果显示,它的最适p H由6.5降低至5.5,且在p H 5.5条件下的酶活较野生酶提高了3.4倍。其对d-果糖和d-甘露糖的动力学参数K分别为78.77 mM和328.12 mM,k/K分别为15.37 mM·min和48.92 mM·min。同时,在80℃和p H 5.5条件下,以80 g/L的d-果糖为底物时,10 h后d-果糖转化率达18%,高于野生酶(17%)。此外,突变体E82K/P105K在p H 5.5条件下的美拉德程度较p H 6.5条件下显著降低。因此,本课题的分子改造成功提高了Thar-d-LIase在酸性环境下的催化能力,同时降低了美拉德反应。

关键词： d-甘露糖 d-来苏糖异构酶酶学性质弱酸性改造美拉德反应

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表乳糖的合成研究

有机化学 2017年第2期37卷 375-384页

作者：王家尧姜锐梁晓梅金淑惠王道全张建军中国农业大学理学院北京100193

表乳糖又名依匹乳糖,作为一种还原性双糖具有良好的益生效果.以d-甘露糖、d-半乳糖为起始原料,通过合成不同的供体与受体进行偶联筛选,确定了一条表乳糖合成的最佳路线.其总收率达到50%,适宜表乳糖的大量制备.中间体及最终产物的结构均... 详细信息

表乳糖又名依匹乳糖,作为一种还原性双糖具有良好的益生效果.以d-甘露糖、d-半乳糖为起始原料,通过合成不同的供体与受体进行偶联筛选,确定了一条表乳糖合成的最佳路线.其总收率达到50%,适宜表乳糖的大量制备.中间体及最终产物的结构均通过NMR、HRMS进行表征.

关键词：表乳糖(依匹乳糖) d-甘露糖 d-半乳糖合成

趁鲜切制和传统切制金荞麦饮片糖类组分比较研究

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中草药 2023年第9期54卷 2776-2784页

作者：陈芳倪丽缪兴龙周桂荣何毅李松林南京中医药大学附属中西医结合医院江苏南京210028 江苏省中医药研究院和中国中医科学院江苏分院江苏南京210028 天士力医药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室天津300410

目的比较趁鲜切制和传统切制方法对金荞麦Fagopyri dibotryis Rhizoma饮片糖类组分的影响,基于糖组分探究适宜的金荞麦饮片切制方法。方法采用多维色谱技术表征2种饮片中多糖含量、相对分子质量分布、单糖组成及物质的量比以及寡糖和游... 详细信息

目的比较趁鲜切制和传统切制方法对金荞麦Fagopyri dibotryis Rhizoma饮片糖类组分的影响,基于糖组分探究适宜的金荞麦饮片切制方法。方法采用多维色谱技术表征2种饮片中多糖含量、相对分子质量分布、单糖组成及物质的量比以及寡糖和游离单糖的含量,结合统计分析,比较2种饮片的糖组分特征。结果与传统切制法相比,趁鲜切制饮片中多糖、寡糖含量较高;2种饮片中多糖的相对分子质量分布范围相似,但传统方法切制饮片在4.456×10^(6)~8.095×10^(6)区域占比较高;2种饮片多糖都主要由d-甘露糖、d-半乳糖醛酸、d-葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,但传统方法切制饮片的d-葡萄糖物质的量比较高,d-甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖物质的量比较低。结论趁鲜切制能更好地保留多糖和寡糖组分,且操作方法相对简便,可以考虑作为金荞麦饮片的候选切制方法。

关键词：金荞麦糖类组分趁鲜切制传统切制 d-甘露糖 d-半乳糖醛酸 d-葡萄糖半乳糖阿拉伯糖