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Establishment of primary cultures of craniopharyngioma cells

Neural Regeneration Research 2012年第8期7卷 601-605页

作者： Hao Liu Liang Liu Zhiyong Liu Qiang Li Chao You Jianguo Xu Department of Neurosurgery West China Hospital Sichuan University Chengdu 610041 Sichuan Province China Department of Neurosurgery Affiliated Hospital of Luzhou Medical College Luzhou 646000 Sichuan Province China

Craniopharynigoma samples were collected from 36 patients. Out of the 36 samples, 29 achieved successful sub-culturing, with a success rate of 80.6%. Immunohistochemistry staining showed that cytokeratin-7 was positively expressed in the cytomembrane and cytoplasm of craniopharyngioma cells at 6-8 passages, confirming that all cultured cells were squamous epithelial cells. The doubling time of craniopharyngioma cells was 3 days, as confirmed by the 3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. In this study, craniopharyngioma cells cultured in vitro were established; however, establishment of immortalized craniopharyngioma cell lines requires further research.

关键词： craniopharyngioma cytokeratin-7 primary culture culture in vitro cell line

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人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良

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作者：左彦珍承德医学院

学位级别：硕士

目的：滋养细胞源于胚胎外滋养层，生长迅速。在胚囊表面形成许多毛状突起，称之“绒毛”(villi)。滋养层最早由一层扁平立方形细胞构成，到绒毛形成时逐渐分化为两层。内层与间质接触，称“细胞滋养层细胞(cytotrophoblast)”;外层与... 详细信息

目的：滋养细胞源于胚胎外滋养层，生长迅速。在胚囊表面形成许多毛状突起，称之“绒毛”(villi)。滋养层最早由一层扁平立方形细胞构成，到绒毛形成时逐渐分化为两层。内层与间质接触，称“细胞滋养层细胞(cytotrophoblast)”;外层与子宫蜕膜接触，称“合体滋养层细胞(syncytiotrophoblast)”。滋养细胞通过侵袭子宫内膜、肌层及螺旋动脉，而建立子宫胎盘循环。所以说人类胚胎的成功着床、胎盘的形成、胚胎的生长发育，与滋养细胞的增殖分化以及侵袭功能密切相关。胚胎的植入过程需要滋养层细胞对子宫基质的侵入，源自胚胎原始滋养细胞的绒毛外滋养层细胞发挥类似肿瘤细胞浸润的特性,通过其侵入子宫基质将胚胎粘附于子宫壁组织,并伴随胚胎逐渐发育完善。但是不同于恶性肿瘤，滋养层细胞的侵入过程中一系列复杂的彼此关联的事件受到严格的时空调控。若发生调节紊乱可导致一系列的妊娠相关疾病，如侵入不足会导致自然流产、宫内发育迟缓、先兆子痫、妊高征等，而过度的侵入会导致妊娠滋养细胞疾病（gestational trophoblastic disease,GTD），如葡萄胎、侵袭性葡萄胎、绒癌及罕见的胎盘部位滋养细胞肿瘤等。对这些与滋养细胞相关疾病的研究，需要滋养细胞体外培养模型的建立提供重要的实验基础。目前滋养细胞的体外模型主要有原代滋养细胞和滋养细胞系两大类。人滋养细胞系有：SGHPL、TCL-1、JAR、 JEG-3、HTR-8/SVneo、BeWo、SM10、TEV-1、Rcho-1、HPT-8等。滋养细胞系操作方便，但是任何一个滋养细胞系都无法完全替代原代滋养细胞。滋养细胞原代培养方法操作繁琐、产量低、纯度低、临床取材困难，限制了原代滋养细胞的实验研究。所以寻求简便高效的原代滋养细胞体外培养方法非常重要。人早孕绒毛中包括合体滋养层细胞、细胞滋养层细胞、红细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、子宫基质细胞和蜕膜细胞等。而细胞滋养细胞是各型滋养层细胞的备用库。国内外关于滋养细胞原代培养的方法有一些，但是由于细胞滋养细胞在胎盘中所处的位置，采用不同方法所得到的细胞数及纯度也各不相同。建立一种简便、稳定、高纯度和高数量的滋养细胞体外模型，可以为滋养细胞及相关疾病的研究提供重要的实验基础，促进滋养细胞及相关疾病的研究进展。方法：1取材无菌条件下获取新鲜的人工流产正常胎盘绒毛组织一至两例，孕龄5-8周。2分离用含青链霉素的冷PBS冰上冲洗三次，眼科镊去掉明显的血块。完整的组织直接放入无菌的小青瓶中，加入含EDTA的胰酶和胶原酶，置于37℃温箱中反复消化，终止，取上清。至镜下观察绒毛外的滋养层细胞已基本消化干净，肉眼也可看到残存组织绒毛部位多呈白色纤维状。收集3次消化的上清200目筛网过滤，离心，弃上清，重悬。3纯化将分离所得细胞悬液加入预先铺好的60%percoll、35%percoll液的15mL离心管中，离心。吸取60%percoll与35%percoll分离液之间的云雾层条带，离心洗涤两次。最后用含20%特级胎牛血清的DMEM/F12重悬，台盼蓝染色，调整细胞密度为1×105接种于培养皿和多聚赖氨酸铺板的无菌盖玻片上培养。4传代胰蛋白酶消化传代5细胞倒置显微镜下观察培养的细胞直接在倒置显微镜下观察并拍照6滋养细胞纯度的鉴定新鲜早孕胎盘绒毛组织经多聚甲醛固定，脱水，包埋，制片，分别做HE染色和免疫组化染色。细胞爬片用免疫细胞化学法观察细胞的细胞角蛋白（cytokeratin-7）和波形蛋白（vimentin）的表达。结果：1细胞的活性活细胞的百分比为95%以上。2细胞形态学观察和生长特性分离纯化后的细胞大而均一，1h后开始贴壁，个别细胞开始伸展，24h后80%以上细胞完全贴壁伸展，细胞呈胖三角型或不规则的多角形或圆形，胞核较大，胞浆丰富，高倍镜下见有丰富的胞浆突起，显示绒毛滋养层细胞特征。4-6天后细胞融合率达80%，传代后3-4天一代。3组织HE染色和免疫组化结果：组织HE染色，确定了绒毛位置和形态。免疫组化结果可见细胞滋养细胞CK-7（cytokeratin-7）染色表达呈强阳性，合体滋养细胞CK-7染色表达呈弱阳性，间质细胞表达阴性;Vimentin染色可见绒毛内部的纤维细胞表达强阳性，而外部的细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞均表达阴性;PBS做一抗的阴性对照组均呈阴性表达。4免疫细胞化学结果CK-7阳性表达的细胞大于90%;vimentin染色阴性，偶见亦呈弱阳性表达，表达部位主要在胞质;阴性对照组染色呈阴性结论：1

关键词：滋养细胞原代培养早孕绒毛 Percoll密度梯度分离法胎盘 cytokeratin-7

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