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作者：李新四川农业大学

学位级别：硕士

本研究通过改良细胞培养方案,建立体外诱导RAW264.7细胞分化形成成熟破骨细胞(OC)的高效培养体系,在解决OC体外诱导相关难题的基础上,本研究另一方面,还从细胞、生化、形态学水平分析本实验室纯化的鲢鱼cystatin在体外对小鼠RAW264.7细... 详细信息

本研究通过改良细胞培养方案,建立体外诱导RAW264.7细胞分化形成成熟破骨细胞(OC)的高效培养体系,在解决OC体外诱导相关难题的基础上,本研究另一方面,还从细胞、生化、形态学水平分析本实验室纯化的鲢鱼cystatin在体外对小鼠RAW264.7细胞分化为OC的影响,以及其对成熟OC的影响,从破骨角度初步阐明鲢鱼cystatin在骨生长过程中调节骨吸收的作用。本研究结果为高效、合理利用鲢鱼废弃物资源,变废为宝,奠定必要的实验基础,并提供可靠的理论依据。1.体外诱导RAW264.7细胞分化形成成熟OC的高效培养体系的建立本研究联合应用三种细胞因子M-CSF、RANKL和1α,25-(OH)2D3诱导Raw 264.7细胞分化为OC,同时利用低浓度胰酶短暂消化保证OC前体细胞始终保持单层细胞的生长状态,建立了体外诱导RAW264.7细胞分化为成熟OC的高效培养体系。通过改良培养方法,在诱导过程中,培养孔内的大部分区域始终保持单层细胞的生长状态。镜下观察和HE染色结果显示,诱导第12天时OC胞体覆盖培养面积的70%;FITC-phalloidin染色结果显示,伴随着OC成熟,伪足内的束状伪足小体逐渐变为环形,最终融合成带状肌动蛋白环环绕在胞质周围;免疫荧光染色结果显示OC表达的降钙素受体(CTR)较前体细胞显著增加;TRAP染色显示OC胞浆内呈现大量红色颗粒。上述结果均提示获得具有吞噬功能的成熟OC。2.鲢鱼cystatin对骨吸收的影响首先,本研究探究了鲢鱼cystatin对小鼠RAW264.7向OC分化的影响。①Alexa Fluor546-phalloidin荧光染色表明,对照组可见伪足小体簇融合而成的伪足小体带环绕OC周边胞质,荧光强度高;10ng/mL鲢鱼cystatin组OC周边胞质内仅见很多小的环状伪足小体;100ng/mL鲢鱼cystatin组OC周边胞质内仅看见点状分布的伪足小体簇;而500ng/mL浓度组无伪足小体簇形成。免疫组化法检测OC微管蛋白分布的变化,对照组可见环状微管蛋白环绕成熟OC细胞的周边胞质;随着鲢鱼cystatin浓度升高,微管蛋白环厚度逐渐变小,直径逐渐变窄,荧光强度逐渐减弱,其中500ng/mL浓度组无微管蛋白环形成。②组织蛋白酶K(Cathepsin K CTSK)免疫荧光染色结果显示,培养12d时对照组OC表达大量CTSK,细胞膜和核周细胞质呈现较强的绿色荧光;而其他各组,OC表达CTSK的水平较低,绿色荧光强度降低,500 ng/mL组仅核周少量胞质中呈现微弱的绿色荧光。间接ELISA检测结果显示,随着培养时间的延长(3d、7d及11d),对照组培养液上清中CTSK浓度逐渐上升,10-500 ng/mL各组培养液上清中CTSK浓度则逐渐降低,其下降幅度与鲢鱼cystatin浓度呈正相关,500ng/mL组CTSK浓度为零。③微板法检测Ca2+浓度的结果显示,随着培养时间的延长(3d、7d及11d)对照组培养液上清中Ca2+浓度逐渐上升,10-500 ng/mL鲢鱼cystatin各组培养液上清中Ca2+浓度则逐渐降低,以500 ng/mL组降低幅度最为明显,至11d时培养液上清中Ca2+浓度基本为零。本研究还检测了鲢鱼cystatin对成熟OC功能的调节,①Alexa Fluor546-phalloidin荧光染色结果显示,对照组OC周边胞质内可见带状的伪足小体带,荧光强度高;10ng/mL鲢鱼cystatin组OC周边胞质中的伪足小体带解聚成大量点状聚集的伪足小体簇;1OOng/mL组OC周边胞质中仅见少量伪足小体簇;500ng/mL浓度组OC周边胞质中伪足小体消失。②免疫荧光组化法检测OC微管蛋白环分布的变化,结果显示:对照组成熟OC细胞周边胞质可见稳定的微管蛋白环,10ng/mL鲢鱼cystatin组OC的微管蛋白环厚度变薄,荧光强度变弱,100和500ng/mL组微管蛋白环消失。③CTSK免疫荧光组化染色显示,对照组培养12d时OC表达大量CTSK,细胞膜和核周细胞质中均呈现较强的绿色荧光;其他各组OC表达CTSK的水平逐渐降低,绿色荧光的强度降低,500 ng/mL组仅核周少量胞质中呈现微弱的绿色荧光。间接ELISA检测培养液上清中CTSK浓度,随着培养时间延长,对照组培养液上清中CTSK含量逐渐上升,10-500 ng/mL鲢鱼cystatin各组培养液上清中CTSK含量逐渐降低,下降幅度与鲢鱼cystatin浓度呈正相关,500 ng/mL组CTSK浓度降为零。④微板法检测培养液上清Ca2+浓度,随着培养时间延长,对照组培养液上清中Ca2+含量上升,而10-500ng/mL鲢鱼cystatin各组培养上清中Ca2+含量均降低,500ng/mL组降为零。⑤利用Annexi

关键词：鲢鱼 cystatin RAW264.7细胞破骨细胞骨吸收

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鼻咽癌患者血清MIP-3α与cystatin A表达及其临床意义

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中国癌症杂志 2013年第10期23卷 845-851页

作者：李军汤敏中陆爱英钟伟铭高健全郑裕明曾洪陈万生梁伟蔡永林梧州市卫生系统鼻咽癌病因学及分子机理重点实验室广西梧州543002 梧州市红十字会医院医学检验科广西梧州543002 北京工业大学生命科学与生物工程学院北京100022 梧州市红十字会医院肿瘤科广西梧州543002

背景与目的:目前,检测鼻咽癌的病灶残留、复发、远处转移,评价放化疗敏感性及判断预后主要依赖影像学的检查。寻找鼻咽癌早期诊断及预后相关的特异性分子标志物对鼻咽癌的早期诊断及个体化治疗具有重要意义。本研究通过检测血清巨噬细... 详细信息

背景与目的:目前,检测鼻咽癌的病灶残留、复发、远处转移,评价放化疗敏感性及判断预后主要依赖影像学的检查。寻找鼻咽癌早期诊断及预后相关的特异性分子标志物对鼻咽癌的早期诊断及个体化治疗具有重要意义。本研究通过检测血清巨噬细胞炎性蛋白-3α(macrophage inflammatory protein-3α,MIP-3α)和cystatin A蛋白在鼻咽癌患者治疗前、后及健康人中的表达情况,探讨其在鼻咽癌诊断、与临床病理特征关系以及疗效评价中的作用。方法:应用定量酶联免疫吸附法检测140例初治无远处转移的鼻咽癌患者治疗前、治疗结束后血清中MIP-3α和cystatin A的表达情况,并以100名健康体检者为对照。结果:以血清MIP-3α水平为31 pg/mL及cystatin A水平为16 ng/mL诊断鼻咽癌的敏感度分别为92.1%及42.1%,特异度分别为86.0%及85.0%。140例鼻咽癌患者经过治疗后均达到完全缓解或者部分缓解。鼻咽癌患者治疗前血清MIP-3α和cystatin A水平显著高于治疗后和健康对照者。MIP-3α和cystatin A均与鼻咽癌临床分期相关,MIP-3α还与T分期有关。治疗后完全缓解患者的血清MIP-3α降至健康对照者水平。部分缓解患者仍高于健康对照者水平,而完全缓解与部分缓解患者的血清cystatin A均降至健康对照者水平。在1年内发生远处转移的患者治疗后血清MIP-3α和cystatin A水平均明显高于未发生远处转移患者和健康对照者。MIP-3α和cystatin A表达之间存在相关性。结论:血清MIP-3α水平作为辅助诊断鼻咽癌的指标有一定的临床意义。血清MIP-3α与cystatin A检测有助于判断鼻咽癌分期和治疗后的近期疗效。

关键词：鼻咽癌巨噬细胞炎性蛋白-3α cystatin A 临床疗效

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橡胶树cystatin基因HbCYS1的克隆及割胶应答

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热带作物学报 2011年第5期32卷 833-839页

作者：戚继艳李和平阳江华唐朝荣海南大学农学院海南儋州571737 中国热带农业科学院橡胶研究所海南儋州571737

在植物中,半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)广泛参与逆境胁迫应答和发育调控。在已建立的胶乳EST序列数据库中,鉴定了一个注释为cystatin的序列重叠群(Contig)。利用RACE和RT-PCR进一步获得1个长度为947 bp、包含完整读码框(741 bp)的cD... 详细信息

在植物中,半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)广泛参与逆境胁迫应答和发育调控。在已建立的胶乳EST序列数据库中,鉴定了一个注释为cystatin的序列重叠群(Contig)。利用RACE和RT-PCR进一步获得1个长度为947 bp、包含完整读码框(741 bp)的cDNA,命名为HbCYS1;去除N端27个aa的信号肽后,HbCYS1蛋白生成1个包含219个aa的成熟蛋白(24.2 ku),具有cystatin反应位点的保守序列基序GG、QXVXG和A/PW,同时具有植物cystatin所特有的LARFAV基序;推测HbCYS1是一种分泌性蛋白,与同样来自大戟科的1个蓖麻cystatin蛋白(CAA89697)的亲缘关系最近,氨基酸序列的一致性达79%;在胶乳中,割胶明显促进HbCYS1基因的上调表达。割胶是一种典型的非生物胁迫,橡胶树对割胶胁迫的适应能力是决定其持续生产力的一个重要因素,推测HbCYS1基因可能参与橡胶树的胁迫应答与胶乳再生。

关键词：橡胶树 cystatin cDNA克隆 HbCYS1 序列分析割胶应答

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食管癌组织中cystatin B基因、D10-86 cDNA片段的表达

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郑州大学学报（医学版） 2004年第2期39卷 235-238页

作者：郭长青王明荣李继昌徐峰陈宝生徐昕蔡岩韩亚玲吴旻郑州大学第一附属医院消化内科郑州450052 中国医学科学院.协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室北京100021

目的:研究食管癌组织中cystatin B基因、D10-86 cDNA片段的表达及相关性。方法:采用RT-PCR方法检测了41对食管癌组织及配对食管癌旁正常黏膜cystatin B基因、D10-86 cDNA片段的表达。结果:cystatin B基因、D10-86 cDNA片段各在82.9％(34... 详细信息

目的:研究食管癌组织中cystatin B基因、D10-86 cDNA片段的表达及相关性。方法:采用RT-PCR方法检测了41对食管癌组织及配对食管癌旁正常黏膜cystatin B基因、D10-86 cDNA片段的表达。结果:cystatin B基因、D10-86 cDNA片段各在82.9％(34/41)、41.5％(17/41)食管癌组织中的表达水平低于配对的食管癌旁正常黏膜,cystatin B基因的表达下调情况显著高于D10-86 cDNA片段(P0.05)。结论:cystatin B基因、D10-86 cDNA片段在食管癌中表达下调,可能源于不同的机制。2者可能分别是由不同的机制而导致在食管癌组织中表达下调。

关键词： cystatin B基因 D10—86 cDNA片段食管肿瘤基因表达逆转录聚合酶链反应

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Role of cystatin C and renal resistive index in assessment of renal function in patients with liver cirrhosis

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World Journal of Gastroenterology 2014年第21期20卷 6573-6579页

作者： Dorde Culafi Milos tuli Radmila Obrenovi Danijela Mileti Dragana Mija Milica Stojkovi Marija Jovanovi Milica Culafi Clinic of Gastroenterology and Hepatology Clinical Center of Serbia and School of Medicine University of Belgrade Institute of Medical Biochemistry Clinical Center of Serbia Department of Pharmacoki-netics and Clinical Pharmacy Faculty of Pharmacy University of Belgrade

AIM:To evaluate the clinical significance of cystatin C and renal resistive index for the determination of renal function in patients with liver ***:We conducted a study of 63 patients with liver cirrhosis.A control group comprised of 30 age and gender-matched healthy *** cystatin C was determined in all study subjects and renal Doppler ultrasonography was *** glomerular filtration rate from serum creatinine(GFRCr)and cystatin C(GFRCys)was ***:We confirmed significant differences in val-ues of cystatin C between patients with different stages of liver cirrhosis according to Child-Pugh(P=0.01),and a significant correlation with model of end stage liver disease(MELD)score(rs=0.527,Pcystatin C(rs=0.283,P=0.028)and showed a negative correlation with GFRCys(rs=-0.31,P=0.016).CONCLUSION:cystatin C may be a more reliable marker for assessment of liver ***,cystatin C and renal resistive index represent sensitive indicators of renal dysfunction in patients with liver cirrhosis.

关键词： Liver cirrhosis cystatin C Renal resistive index

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蛇毒cystatin在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

蛇毒cystatin在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

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作者：张晓艳福建医科大学

学位级别：硕士

目的探讨蛇毒cystatin 在Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统中的表达。方法根据中华眼镜蛇蛇毒cystatin 蛋白的氨基酸序列合成cystatin 基因的四个片段,通过缓慢退火PCR 的方法将其拼接为完整的cystatin 基因,PCR 扩增蛇毒cystatin 基因,... 详细信息

目的探讨蛇毒cystatin 在Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统中的表达。方法根据中华眼镜蛇蛇毒cystatin 蛋白的氨基酸序列合成cystatin 基因的四个片段,通过缓慢退火PCR 的方法将其拼接为完整的cystatin 基因,PCR 扩增蛇毒cystatin 基因,将其克隆到供体质粒pFastBacHTc 中,通过转化DH10Bac 菌筛选、鉴定并抽提获取高纯度的重组穿梭载体Bacmid-cystatin,经脂质体介导将重组穿梭载体转染Sf9 细胞,获取并扩增重组病毒,空斑分析确定病毒滴度,Western-blot分析适宜的重组融合蛋白表达时间和MOI 值,SDS-PAGE 分析细胞总蛋白,Western-blot 鉴定重组融合蛋白。结果 1 构建了携带蛇毒cystatin基因片段的重组供体质粒pFastBacHTc -cystatin,经双酶切鉴定和序列分析证实蛇毒cystatin 基因已正确插入供体质粒的多克隆位点。 2 构建了携带蛇毒cystatin 基因片段的重组穿梭载体Bacmid-cystatin,经PCR 鉴定分析证实蛇毒cystatin 基因已正确转座插入穿梭载体的转座接触位点。 3 确定了重组融合蛋白在Sf9 细胞中表达的最佳时间是感染后96 h,适宜的MOI 值为10。该重组融合蛋白经SDS-PAGE、Western-blot 分析鉴定为蛇毒6×His-cystatin 融合蛋白,分子量为15000 道尔顿,与融合蛋白的理论分子量相

关键词： cystatin 基因克隆 Sf9 细胞杆状病毒表达系统

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cathepsin B与cystatin C在食管癌中的表达及意义

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广东医学 2017年第9期38卷 1402-1405页

作者：何琳莉高驰丹文彬川北医学院病理教研室四川南充637000

目的探讨在食管癌(EC)发生、发展中,组织蛋白酶B(cathepsin B)与半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)的表达及意义,并研究其在EC中的作用。方法选取EC切除术患者120例、癌旁组织120例与食管高级别上皮内瘤变患者54例,取其病理标本及临床... 详细信息

目的探讨在食管癌(EC)发生、发展中,组织蛋白酶B(cathepsin B)与半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)的表达及意义,并研究其在EC中的作用。方法选取EC切除术患者120例、癌旁组织120例与食管高级别上皮内瘤变患者54例,取其病理标本及临床病理资料,采取免疫组化法检测cathepsin B、cystatin C表达,观测其阳性率及与5年生存率的关系。结果 EC组织、癌旁正常组织与食管高级别上皮内瘤变组织中,cystatin C阳性率分别为37.50%、86.67%、66.67%,cathepsin B阳性率分别为47.50%、0.00%、7.41%,差异均有统计学意义(Pcystatin C及cathepsin B表达呈负相关(Pcystatin C蛋白表达与临床分期有相关性(Pcystatin C阳性组与cystatin C阴性组5年生存率差异无统计学意义(P>0.05);cathepsin B阳性组5年生存率显著低于阴性组,差异有统计学意义(Pcystatin C不能作为独立提示预后的因素。

关键词：食管癌 cathepsin B cystatin C 免疫组化学法病理因素

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腹腔镜手术CO2气腹对患者血NGAL和cystatin C水平及NGAL基因表达的影响

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中华普通外科杂志 2012年第7期27卷 591-592页

作者：李红梅尹忠诚卜姗姗李胜开张颖徐州医学院附属医院肾内科江苏省221000

急性肾损伤（acute kidney injury；AKI）是临床常见的急危重症。本研究通过检测腹腔镜手术患者血中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase—associated lipocalin；NGAL）和胱抑素C（cystatin C；Cys C）的变化，及N... 详细信息

急性肾损伤（acute kidney injury；AKI）是临床常见的急危重症。本研究通过检测腹腔镜手术患者血中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase—associated lipocalin；NGAL）和胱抑素C（cystatin C；Cys C）的变化，及NGAL蛋白及mRNA表达水平的变化，评估腹腔镜手术CO2气腹对肾功能的影响。

关键词： cystatin 腹腔镜手术 CO2气腹 NGAL 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白基因表达患者 lipocalin

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cystatin C与血肌酐在估算透析患者残余肾功能中的比较研究

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江西医学院学报 2009年第6期49卷 52-55,58页

作者：李辉陈红钟爱民南昌大学研究生院医学部 2006级南昌330006 江西省人民医院肾内科南昌330006

目的探讨cystatin C在评估慢性肾功能衰竭透析患者残余肾功能(RRF)中的应用价值,寻找一种对透析患者较简便、精确的RRF估算指标。方法收集95例透析患者(其中血液透析患者61例,腹膜透析患者34例)的血、尿标本分别测定血肌酐(Scr)和尿肌酐... 详细信息

目的探讨cystatin C在评估慢性肾功能衰竭透析患者残余肾功能(RRF)中的应用价值,寻找一种对透析患者较简便、精确的RRF估算指标。方法收集95例透析患者(其中血液透析患者61例,腹膜透析患者34例)的血、尿标本分别测定血肌酐(Scr)和尿肌酐(Ucr)以及cystatin C浓度,分析血清cystatin C能否很好地估算透析患者的RRF,并且将它估算的RRF(eGFR1)同标准的RRF以及肾脏病膳食改良试验(MDRD)公式得出的RRF(eG-FR2)进行比较。结果所有透析患者cystatin C和Scr浓度均伴随着RRF的降低而上升,但cystatin C的上升幅度比Scr平稳。血液透析及腹膜透析患者cystatin C、Scr与RRF均呈负相关(r=-0.53、r=-0.46,Pcystatin C和Scr测得eGFR与RRF均呈正相关(r=0.69、r=0.63,Pcystatin C测得eGFR与RRF的相关性更好。结论cystatin C估算透析患者RRF准确、简便,在24 h尿标本难于准确收集的情况下,cystatin C比Scr更适合透析患者RRF的估算。

关键词： cystatin C 血液透析腹膜透析残余肾功能

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蛇毒cystatin分离及其合成基因在COS7细胞中的表达

蛇毒cystatin分离及其合成基因在COS7细胞中的表达

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作者：郑海音福建医科大学

学位级别：硕士

目的1、中华眼镜蛇毒cystatin的分离并探讨其体外抗肿瘤细胞侵袭的能力;2、探讨蛇毒cystatin合成基因在真核表达系统(COS7)中的表达。方法1、运用亲和层析、凝胶过滤等方法,从中华眼镜蛇毒中分离出半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin);通过... 详细信息

目的1、中华眼镜蛇毒cystatin的分离并探讨其体外抗肿瘤细胞侵袭的能力;2、探讨蛇毒cystatin合成基因在真核表达系统(COS7)中的表达。方法1、运用亲和层析、凝胶过滤等方法,从中华眼镜蛇毒中分离出半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin);通过酶抑制动力学、液相色谱分析、SDS-PAGE等方法鉴定其理化性质;并运用体外重组基底膜实验分析蛇毒cystatin对B16小鼠黑色素瘤细胞侵袭转移能力的影响。2、根据中华眼镜蛇毒cystatin蛋白的氨基酸序列合成cystatin基因的四个片段,通过缓慢退火PCR的方法将其拼接为完整的cystatin基因;PCR扩增蛇毒cystatin基因;构建携带蛇毒cystatin基因片段的真核表达载体;脂质体介导的基因转染法将重组质粒转染COS7细胞;SDS-PAGE分析表达产物;ProBondTM蛋白纯化系统纯化融合蛋白,Western-blot鉴定。结果1、通过凝胶过滤、亲和层析从中华眼镜蛇毒中分离得到一小分子量半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin),经酶抑制动力学分析,该小分子半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有明显抑制木瓜蛋白酶(papain)的活性;经高效液相色谱分析该活性物质为单一组分。2、该小分子cystatin在体外重组基底膜侵袭实验中具有抑制B16小鼠黑色素瘤细胞侵袭的能力。

关键词：中华眼镜蛇毒 cystatin 肿瘤细胞侵袭基因克隆 COS7细胞真核表达

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