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Inhibition of p38 activity reverses claudin-6 induced cell apoptosis, invasion, and migration

Chinese Medical Journal 2013年第18期126卷 3539-3544页

作者： WU Qiong LIU Xing, LIU Ya-fang LU Yan WANG Li-ping ZHANG Xiao-wei LI Yu-lin QUAN Cheng-shi Key Laboratory of Pathobiology Ministry of Education Jilin University Changchun Jilin 130021 China Department of Pathology China-Japan Union Hospital of Jilin University Changchun Jilin 130033 China College of Basic Medical Sciences Jilin University Changchun Jilin 130021 China

Background claudin-6 is a protein component of tight junctions and its expression could downregulate the malignant phenotype of breast carcinoma. Here we investigated the mechanisms of claudin-6 induced human MCF-7 breast cancer cells apoptosis, invasion, and migration. Methods Terminal deoxyribonucleotide transferase-mediated nick-end labeling assay and Annexin-V/PI double stain assay were carried out to evaluate apoptosis. Inhibitors of each pathway were used to inactivate the signaling pathways. The expression of claudin-6 and phosphate p38, Erk 1/2 and Akt protein levels was confirmed by Western blotting analysis. Invasive and migratory traits of claudin-6 expressing cells were determined by Boyden chamber invasion assay and monolayer wound-healing assay. Results Cells with high-level expression of claudin-6 had a higher rate of apoptosis than control cells. Western blotting assay showed that by contrast to control groups, p38 pathways were more activated in claudin-6 expressing cells. However, after inhibitor SB203580 treatment, the activation status could be significantly counteracted. Furthermore, by applying inhibitors to the apoptotic rate, invasive and migratory traits were also recovered in cells with claudin-6 expression. Conclusion claudin-6 may function through p38 mitogen-activated protein kinase pathway, of which inhibition may reverse claudin-6-induced cell apoptosis, invasion, and migration.

关键词： claudin-6 p38 apoptosis invasion migration

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17β-雌二醇对紧密连接蛋白claudin-6表达及乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响

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中华病理学杂志 2010年第1期39卷 44-47页

作者：刘亚芳吴琼许晓明任玥于立娜全成实李玉林吉林大学病理生物学教育部重点实验室长春130021

目的研究雌激素调控紧密连接蛋白claudin-6表达和对乳腺癌细胞MCF-7细胞生物学行为的影响。方法用17β-雌二醇（17p—E2）作用MCF-7细胞后，采用RT—PCR和免疫细胞化学法分析claudin-6表达与17p—E2的浓度和时间效应关系；采用CellCoun... 详细信息

目的研究雌激素调控紧密连接蛋白claudin-6表达和对乳腺癌细胞MCF-7细胞生物学行为的影响。方法用17β-雌二醇（17p—E2）作用MCF-7细胞后，采用RT—PCR和免疫细胞化学法分析claudin-6表达与17p—E2的浓度和时间效应关系；采用CellCountingKit-8（CCK-8）检测17B—E2对MCF-7细胞增殖的影响；采用细胞划痕法检测17B—E2对MCF-7细胞迁移能力的影响。结果RT—PCR结果显示，17β—E2能够诱导MCF-7细胞表达claudin-6，其诱导表达具有浓度和时间依赖性，其最佳浓度和时间分别为5nmol／L和24h；细胞免疫荧光法检测显示，17β—E2组claudin45主要表达于细胞膜；CCK-8结果显示，5mnol／L17β—E2作用24h可明显抑制MCF-7细胞的生长（P〈0．05）；细胞划痕实验显示，5nmol／L17β—E2作用24h具有抑制MCF-7细胞迁移的趋势，但差异无统计学意义。结论17β—E2可以调控claudin-6表达，并具有抑制MCF-7细胞的增殖和迁移的作用。推测17β—E2调控claudin-6表达可能在影响MCF-7细胞生物学行为的过程中发挥一定作用。

关键词：乳腺肿瘤雌激素连接蛋白类 claudin-6

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紧密连接蛋白claudin-6在人乳腺癌细胞和组织中的表达及其与乳腺癌淋巴结转移的关系

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吉林大学学报（医学版） 2008年第2期34卷 274-277,F0003页

作者：吴琼吴晓艳张海英刘亚芳任玥曲珊珊全成实李玉林吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室吉林长春130021

目的:探讨紧密连接蛋白claudin-6在人乳腺癌细胞株、乳腺癌组织中的表达及与淋巴结转移的关系,为判定乳腺癌淋巴结转移及估计预后提供依据。方法:应用RT-PCR和免疫组织化学S-P法,对人乳腺上皮细胞株HBL-100、低侵袭性乳腺癌细胞株MCF-7... 详细信息

目的:探讨紧密连接蛋白claudin-6在人乳腺癌细胞株、乳腺癌组织中的表达及与淋巴结转移的关系,为判定乳腺癌淋巴结转移及估计预后提供依据。方法:应用RT-PCR和免疫组织化学S-P法,对人乳腺上皮细胞株HBL-100、低侵袭性乳腺癌细胞株MCF-7、高侵袭性乳腺癌细胞株MDA-MB231和38例人乳腺癌组织claudin-6的表达进行检测,同时以30例乳腺良性肿瘤作为对照。结果:claudin-6在HBL-100细胞株中有表达,在乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231中均无表达;乳腺癌组织中claudin-6表达明显低于对照组(Pclaudin-6表达与乳腺癌组织的病理分级及淋巴结转移有关联(P0.05)。结论:claudin-6可能在乳腺癌的发生和转移中起一定的负性调控作用,并可作为判断乳腺癌淋巴结转移和估计预后的参考指标。

关键词： claudin-6 乳腺肿瘤免疫组织化学逆转录聚合酶链反应

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Thermal Water from Uriage-les-Bains Exerts DNA Protection, Induction of Catalase Activity and claudin-6 Expression on UV Irradiated Human Skin in Addition to Its Own Antioxidant Properties

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Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications 2014年第2期4卷 99-106页

作者： Francine Joly Jean-Eric Branka Luc Lefeuvre EPHYSCIENCE Nantes France Laboratoire SEPhRAPHARMA Puteaux France Laboratoires Dermatologiques d’Uriage Neuilly sur Seine France

Aim: In order to decipher the mechanisms underlying the known protective effects of the thermal water from Uriage-les-Bains (TWFULB) on the skin barrier function, we studied its antioxidant properties as well as its effect on the expression of the tight-junctional protein claudin-6, a candidate tumor suppressor factor. Study Design/Methods: In a first step, TBARS and SOD activity assays were performed in an in vitro model of human dermal fibroblasts treated by hypoxanthine/xanthine oxidase (HO/XO) mixture, in order to evaluate the own antioxidant effect of the thermal water. In a second step, human keratinocytes irradiated or not by UVB were used to evaluate the protective role of TWFULB on nuclear DNA damage using a comet assay. In a third step, an ex vivo model of human skin explants irradiated or not by UVA and UVB was used to evaluate the effect of TWFULB on the intracellular catalase activity and on the cutaneous claudin-6 expression. Results: TWFULB showed significant protective effects against oxidative stress induced by HO/XO: the cell viability was improved and the lipid peroxidation was reduced. The tested thermal water also showed significant SOD-like activity and protective effect on the UVB-stressed DNA. Considering the ex vivo models of skin explants, TWFULB was able to counterbalance the “negative” effect of UVB on the intracellular catalase activity and on the cutaneous claudin-6 ***: This multiparametric approach shows the antioxidant activity of TWFULB and emphasizes its role in the DNA protection of the cutaneous tissue in front of the UV irradiations, and finally suggests that some effects could involve the candidate suppressor functions of claudin-6.

关键词： Human Skin UVA-UVB Thermal Water from Uriage-les-Bains claudin-6 Antioxidant Effect SOD-Like Effect Catalase

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claudin-6抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用

Claudin-6抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用

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作者：董兵吉林大学

学位级别：硕士

前列腺癌是前列腺上皮源性恶性肿瘤,转移和复发是晚期前列腺癌患者主要的死亡原因。目前研究认为,肿瘤的生长和转移受多种因素调控,其中紧密连接（tight junction,TJ）与肿瘤细胞的增殖、运动以及侵袭等转移表型密切相关。紧密连接蛋白C... 详细信息

前列腺癌是前列腺上皮源性恶性肿瘤,转移和复发是晚期前列腺癌患者主要的死亡原因。目前研究认为,肿瘤的生长和转移受多种因素调控,其中紧密连接（tight junction,TJ）与肿瘤细胞的增殖、运动以及侵袭等转移表型密切相关。紧密连接蛋白CLDNs作为紧密连接的主要构成成分,其表达异常能够影响紧密连接结构、功能以及相关的细胞信号传递,在上皮来源恶性肿瘤的发生和转移过程中起着重要作用。claudin-6作为紧密连接蛋白CLDNs家族的成员之一,对维护细胞间紧密连接结构和功能起着重要作用。我们课题组的前期研究中,发现claudin-6能够明显抑制乳腺癌,宫颈癌,结肠癌细胞的迁移侵袭能力;推测claudin-6表达沉默可能在上皮来源的恶性肿瘤发生转移过程中发挥着作用。目前,关于前列腺癌细胞中claudin-6是否能够抑制前列腺癌细胞侵袭表型的研究尚未见报道。本文通过使用分子生物学技术,首次研究claudin-6对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用,为前列腺癌治疗提供一定的理论支持。目的:探讨过表达claudin-6对前列腺癌细胞生物学表型的影响。方法:通过RT-PCR和Western Blot方法检测人前列腺癌细胞LNCAP和DU145中claudin-6基因和蛋白的表达状况;利用携带claudin-6的慢病毒转染前列腺癌细胞LNCAP和DU145,经过嘌呤霉素（puromycin;PM）筛选获得过表达claudin-6的稳定克隆;通过RT-PCR、Western Blot及细胞免疫荧光法鉴定慢病毒转染效率以及稳定细胞克隆中claudin-6蛋白的表达和定位;利用CCK-8试剂盒检测前列腺癌细胞的增殖能力并绘制细胞增殖曲线;流式细胞术检测过表达claudin-6后前列腺癌细胞周期的分布情况;通过跨上皮电阻实验检测前列腺癌细胞LNCAP和DU145的跨上皮电阻;通过倒置显微镜观察过表达claudin-6后前列腺癌细胞形态的改变;通过鬼笔环肽荧光染色法观察过表达claudin-6后前列腺癌细胞骨架的改变;细胞划痕实验、Transwell小室实验检测过表达claudin-6后前列腺癌细胞的迁移侵袭能力;Western Blot检测过表达claudin-6后,EMT相关蛋白的表达情况。结果:RT-PCR和Western Blot结果显示,前列腺癌细胞LNCAP和DU145中claudin-6低表达;慢病毒转染后获得过表达claudin-6的稳定克隆LNCAP和DU145;RT-PCR和Western Blot结果显示,过表达claudin-6组的RNA以及蛋白水平表达均明显高于空载组;细胞免疫荧光染色实验结果显示,转染目的基因组中claudin-6均有表达,并且主要表达于细胞膜上,而空载组未见明显表达;CCK-8细胞活性实验结果显示,与空载组相比,过表达claudin-6组细胞的增殖能力均有下降;流式细胞仪检测细胞周期的结果显示,过表达claudin-6组细胞增殖活性与空载组相比均有减弱;通过跨上皮电阻实验结果显示,过表达claudin-6组单层细胞间跨上皮电阻明显高于空载组;倒置显微镜下观察发现过表达claudin-6后,前列腺癌细胞形态向上皮细胞形态转变,呈多角形,胞体扁平,界限不清;通过鬼笔环肽荧光染色法观察过表达claudin-6后前列腺癌细胞骨架Factin荧光强度减弱,胞质中微丝结构不明显;细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验的结果显示,转染目的基因组的迁移能力与空载组相比明显降低;Transwell细胞侵袭实验结果显示,过表达claudin-6组的侵袭能力与空载组相比明显降低;Western Blot结果显示,过表达claudin-6后上皮细胞标志物E-cadherin表达显著上调,而间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin的表达明显下调。结论:过表达claudin-6抑制前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及逆转EMT,增加前列腺癌细胞的紧密连接功能。

关键词：前列腺癌紧密连接 claudin-6 迁移侵袭

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干细胞表面分子claudin-6的结构预测与分析

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上海医学 2012年第11期35卷 947-950,I0005页

作者：范书玥张慧俊曾凡一上海交通大学医学院医学科学研究院发育生物学研究室上海200025

目的应用多种手段对干细胞表面分子claudin-6(CLDN6)进行理化性质和各级结构的预测和分析,探讨CLDN6结构与功能的关系,为CLDN6在再生医学和转化医学上的应用提供理论基础。方法采用ProtParam工具、InterProScan和TMpred工具分析蛋白质... 详细信息

目的应用多种手段对干细胞表面分子claudin-6(CLDN6)进行理化性质和各级结构的预测和分析,探讨CLDN6结构与功能的关系,为CLDN6在再生医学和转化医学上的应用提供理论基础。方法采用ProtParam工具、InterProScan和TMpred工具分析蛋白质一级结构,采用Consensus Secondary Structure Prediction工具对蛋白质二级结构进行预测,通过RaptorX远程同源建模工具预测蛋白质三级结构。结果 CLDN6是由219个氨基酸组成的蛋白质,相对分子质量为23387.7,含有4个跨膜结构域,N末端和C末端均位于细胞质中;二级结构预测结果显示,其以α-螺旋和无规则卷曲为主要构件。结论通过远程同源建模构建了CLDN6蛋白的空间结构,为进一步深入研究CLDN6的功能实现再生医学替代治疗奠定了基础。

关键词： claudin-6 干细胞表面分子跨膜结构域远程同源建模再生医学

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紧密连接蛋白claudin-6和PKCθ在非典型性脑膜瘤组织中的表达

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中国老年学杂志 2012年第3期32卷 592-593页

作者：张广超金银华殷浩姜国锋吉化集团公司总医院吉林吉林132022

非典型性脑膜瘤占成人脑膜瘤的5%～8%,其侵袭性行为导致手术后容易复发。作者前期研究表明claudin-6表达下调可能在脑膜瘤发生和侵袭中起作用〔1〕。蛋白激酶C（PKC）作为细胞增殖、分化和凋亡过程信号转导中的磷脂依赖型蛋白激酶,在维... 详细信息

非典型性脑膜瘤占成人脑膜瘤的5%～8%,其侵袭性行为导致手术后容易复发。作者前期研究表明claudin-6表达下调可能在脑膜瘤发生和侵袭中起作用〔1〕。蛋白激酶C（PKC）作为细胞增殖、分化和凋亡过程信号转导中的磷脂依赖型蛋白激酶,在维持紧密连接（TJs）的功能中发挥重要作用。

关键词：紧密连接蛋白非典型性脑膜瘤 claudin-6 蛋白激酶C

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Beneficial Effect of a Thermal Spring Water on the Skin Barrier Recovery after Injury: Evidence for claudin-6 Expression in Human Skin

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Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications 2012年第4期2卷 273-276页

作者： Francine Joly Cécile Gardille Eric Barbieux Luc Lefeuvre Laboratoire SEPhRAPHARMA Puteaux France Laboratoires Dermatologiques d’Uriage Siège Social Courbevoie France

Aim: To evaluate the possible advantages of dermo-cosmetic products formulated with thermal spring water instead of deionized water. We studied the effect of a dermo-cosmetic product on skin barrier recovery after injury. In one test the product was formulated with de-ionized water and again using the identical product formulated with thermal spring water. Study Design/Methods: Stratum corneum of human skin explants was removed (and not removed for the control) with an ether/acetone mixture. A cosmetic product, either formulated with de-ionized or thermal spring water, was then topically applied on the explants. After a 5-day incubation period, epidermal expression of aquaporine-3, filaggrin, claudin-4 and claudin-6 was studied by using immunohistochemical techniques. Results: The formulation containing de-ionized water seemed to act on the epidermal expression of filaggrin and claudin-4. When thermal spring water was used to make the formulation, we noted that this expression was greatly enhanced. The formulation containing thermal spring water also acted to increase aquaporin-3 and claudin-6 expression. Conclusion: The use of thermal spring water in cosmetic formulations would appear to contribute to the cosmetic product’s efficacy. It was also interesting to note that this study revealed claudin-6 expression in human skin for the first time.

关键词： Keratinocyte Differentiation Thermal Spring Water Barrier Repair claudin-4 claudin-6 Aquaporine 3 Filaggrin

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EphB2调控claudin-6对子宫内膜癌侵袭和转移的影响

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临床与实验病理学杂志 2023年第8期39卷 944-952页

作者：孙帅夏青李凡闵锐韩悦心冯振中李楠蚌埠医学院病理学教研室蚌埠233030 蚌埠医学院第一附属医院病理科蚌埠233030 安徽医科大学第二附属医院病理科合肥230000 蚌埠医学院临床医学院蚌埠233030

目的探讨EphB2和claudin-6的靶向关系,观察敲低和过表达EphB2基因通过调控claudin-6对子宫内膜癌细胞生长、迁移及侵袭的影响。方法采用TCGA数据库分析EphB2在子宫内膜癌和癌旁组织中的差异表达及其与临床病理特征的关系;应用GSEA法预测... 详细信息

目的探讨EphB2和claudin-6的靶向关系,观察敲低和过表达EphB2基因通过调控claudin-6对子宫内膜癌细胞生长、迁移及侵袭的影响。方法采用TCGA数据库分析EphB2在子宫内膜癌和癌旁组织中的差异表达及其与临床病理特征的关系;应用GSEA法预测EphB2可能相关的功能通路;应用TCGA数据库分析EphB2互作基因;利用体外培养子宫内膜癌细胞;采用脂质体转染法转染子宫内膜癌细胞敲低和过表达EphB2基因;采用qRT-PCR法和Western blot法检测敲低和过表达EphB2各组细胞EphB2和claudin-6表达水平;提取转染后细胞进行细胞增殖、迁移和侵袭实验;免疫组化检测EphB2和claudin-6蛋白在子宫内膜样癌中的表达。结果TCGA数据库分析543例患者显示EphB2在子宫内膜癌中高表达,claudin-6可能是EphB2最具相关性基因(R=0.6);GSEA数据库分析显示EphB2表达可能与细胞黏附和细胞连接通路相关。qRT-PCR法显示干扰后EphB2 mRNA表达:阴性对照组:1.055±0.284、siRNA-EphB2组:0.499±0.264。划痕实验法检测不同分组中癌细胞的迁移能力,干扰后划痕愈合率显示:阴性对照组:0.629±0.02、空白对照组:0.676±0.006、siRNA-EphB2组:0.352±0.009;过表达后划痕愈合率显示:空白对照组:0.151±0.012、空载体组:0.271±0.015、EphB2过表达组:0.672±0.011;敲低EphB2后claudin-6表达显著下降,细胞增殖活力明显降低,细胞侵袭能力亦受到明显抑制,差异有统计学意义(P均claudin-6表达明显上升,细胞迁移和侵袭能力亦明显增强,差异有统计学意义(P均claudin-6在子宫内膜样癌(128例)和癌旁组织(28例)中的表达,差异有统计学意义(Pclaudin-6表达水平有关。

关键词：子宫肿瘤子宫内膜癌 EphB2 claudin-6 生物学行为

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人紧密连接蛋白claudin-6真核表达载体的构建

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中国实验诊断学 2009年第10期13卷 1323-1325页

作者：吴琼刘亚芳任玥许晓明于立娜张婷张明子全成实吉林大学病理生物学教育部重点实验室吉林长春130021

目的构建人紧密连接蛋白claudin-6的cDNA真核表达载体。方法应用RT-PCR、T-A克隆、限制性内切酶切及亚克隆等技术将claudin-6基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒中。结果酶切鉴定、PCR扩增以及序列分析表明已经将claudin-6基因... 详细信息

目的构建人紧密连接蛋白claudin-6的cDNA真核表达载体。方法应用RT-PCR、T-A克隆、限制性内切酶切及亚克隆等技术将claudin-6基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒中。结果酶切鉴定、PCR扩增以及序列分析表明已经将claudin-6基因全长序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒中。结论获得了人claudin-6基因的全长cDNA片段,构建了claudin-6原核克隆载体和真核表达载体。实验中发现,中国人claudin-6基因的461位点碱基为A,而GeneBank中西班牙人claudin-6基因的461位点碱基为G,说明claudin-6基因461位点可能存在多态性。

关键词：乳腺癌紧密连接 claudin-6 真核表达载体

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