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circtpcn对宫颈癌Hela细胞生物学行为的影响及机制研究

CircTPCN对宫颈癌Hela细胞生物学行为的影响及机制研究

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作者：都田赵中国医科大学

学位级别：硕士

目的:宫颈癌(Cervical cancer,CC)是世界范围内最常见的妇科肿瘤之一,高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)持续感染已被证实是其组织发生和进展的重要致病因素。近年来,随着HPV预防疫苗的广泛应用,CC的一级预防... 详细信息

目的:宫颈癌(Cervical cancer,CC)是世界范围内最常见的妇科肿瘤之一,高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)持续感染已被证实是其组织发生和进展的重要致病因素。近年来,随着HPV预防疫苗的广泛应用,CC的一级预防取得了一定的成效,其发病率和死亡率在许多发达国家得到了有效控制。然而,较高的HPV感染率和较低的CC发病率,这不仅使CC筛查和初级预防成为卫生经济学的沉重经济负担,也提示个体遗传和免疫状态差异等重要因素是CC进展的重要因素。因此,探索CC发生的分子机制,寻找潜在的治疗靶点是十分必要的。研究证实,人类基因组只有不到2%的核苷酸序列编码蛋白质,而其余的大多数基因被转录成非编码RNA。近年来,随着RNA测序技术和生物信息学的发展,环状RNA(Circular RNA,circRNA)成为继微小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)之后的又一疾病研究的热点。与传统的线性结构的miRNA和lncRNA不同,circRNA是一个共价键闭合的连续环。circRNA由于缺少3’、5’端和多聚A尾,可以避免外切酶和RNase R的降解作用。与线性RNA相比,circRNA保守稳定,具有细胞特异性、组织特异性和阶段特异性。目前,对circRNA生物学功能的研究还处于探索阶段。研究者已经证实circRNA作为竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNAs,ceRNAs),即miRNA海绵,调控靶基因的表达。它们也可以作为转录调节剂或蛋白结合RNA,甚至可以在特定情况下直接翻译成蛋白质。许多潜在的circRNA分子标记物及其通路作为miRNA海绵已经在许多肿瘤中被发现,包括食管鳞癌、胃癌、胰腺导管腺癌、肝癌、结肠直肠癌、早期肺腺癌、胶质瘤和卵巢癌。然而,circRNA的表达谱及circRNA在宫颈癌发生中的作用仍不清楚。课题组前期工作明确了circRNA在宫颈癌中的表达谱,并证实了circRNA circtpcn在宫颈癌组织中高表达。本项目在前期工作的基础上,研究circtpcn对宫颈癌细胞系Hela细胞生物学行为的影响及其作用机制。研究方法:利用生物信息学检索方法预测circtpcn的干扰序列,化学合成siircTPCN(1)、siircTPCN(2)、无关序列sic以及带有FAM荧光的无关序列sicAM。利用转染试剂将上述序列瞬时转染人宫颈癌细胞系Hela细胞。转染后,荧光性显微镜下观察转染sicAM干扰序列的转染效率。转染48小时后,TRIzol法提取总RNA,检测RNA浓度及纯度后,逆转录为cDNA。逆转录PCR条件为:退火:25℃,5min;延伸:42℃,60min;70℃,15min;4℃保存。用circtpcn的特异引物及SYBR Green I荧光染料进行定量PCR检测,所用内参为18S。用miR-634、miR-195-5p、miR-455-3p的特异引物及SYBR Green I荧光染料进行定量PCR检测,所用内参为U6。荧光定量PCR反应条件为:95℃5 min;95℃15s;60℃60 s,共45个循环。CircRNA相对定量采用2法。2=2-(ΔCt siNA-ΔCt sic)),ΔCt siNA=siNA组Ct值的均值-对应内参18S或U6的Ct值的均值,ΔCt sic=sic组Ct值的均值-对应内参18S或U6的Ct值的均值,并将sic组的相对表达量定为1,计算环状RNA的表达差异;转染后24小时,收取细胞,用细胞计数板计数转染干扰序列后的细胞数,进行增殖能力检测实验Hela细胞的增殖情况;转染后24小时,向转染体系中加入MTS试剂,孵育后利用酶标仪检测Hela细胞的增殖能力变化;转染后48小时,收集细胞,用Annexin V/FITC和PI试剂对各组细胞进行染色,孵育后,用流式细胞仪检测各组Hela细胞的凋亡情况。转染24小时后,进行细胞划痕实验。对孔板内转染后Hela细胞进行多条划痕并去除上清,用PBS清洗三遍,加入无血清培养基培养,在不同时间点对划痕变化进行观察;转染24小时后,收集细胞接种至Transwell小室内,上室为无血清培养体系,下室为高血清培养体系,培养24小时后,镜下计数各组穿膜细胞数,检测细胞的侵袭能力变化。结果:瞬时转染转染效率为27.5pmol组:87.5%;55pmol组:91.3%;110pmol组:93.5%。干扰序列物质的量确定为12孔板中55pmol/孔。MTS检测结果与细胞计数结果显示siircTPCN(1)组Hela细胞的生长能力低于sic对照组,差异有统计学意义。干扰序列siircTPCN(1)转染H

关键词： circtpcn 宫颈癌 Hela 生物学行为 miR-634 mTOR

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