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circrnf13通过miR-139-5p/IGF1R轴促进胰腺癌增殖、侵袭及迁移的机制研究

CircRNF13通过miR-139-5p/IGF1R轴促进胰腺癌增殖、侵袭及迁移的...

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作者：刘欣原贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:由于胰腺癌恶性程度高,早期易转移且缺乏良好的诊治标记物,导致患者生存率低且预后不好,现有临床诊断分子标记物不能良好满足临床需求,因此筛选新的高效的胰腺癌诊治靶标尤为关键。本研究验证了circrnf13在胰腺癌中的差异表达,并... 详细信息

目的:由于胰腺癌恶性程度高,早期易转移且缺乏良好的诊治标记物,导致患者生存率低且预后不好,现有临床诊断分子标记物不能良好满足临床需求,因此筛选新的高效的胰腺癌诊治靶标尤为关键。本研究验证了circrnf13在胰腺癌中的差异表达,并探讨了circrnf13对胰腺癌增殖、侵袭及迁移能力的影响及相应分子机制,以期为胰腺癌临床诊治提供新的思路与潜在靶标。方法:本研究经sanger测序鉴定了胰腺癌细胞中circrnf13的环状结构,确认其反向剪接位点。使用实时定量逆转录PCR(Real-time quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR)检测胰腺癌组织与细胞系中circrnf13的表达量。使用RNase R保护实验验证胰腺癌细胞中circrnf13环形结构的稳定性,通过RNA核浆分离实验与荧光原位杂交实验(Fluorescence in situ hybridization,FISH)确认circrnf13在胰腺癌中的亚细胞定位。后续在胰腺癌细胞中转染circrnf13小干扰RNA以敲降circrnf13的表达,通过CCK-8,平板克隆及Ed U实验验证circrnf13对胰腺癌细胞增殖能力的影响,通过流式细胞周期检测验证circrnf13对胰腺癌细胞周期的调控作用,通过划痕愈合实验及Transwell实验验证circrnf13对胰腺癌细胞侵袭与迁移能力的影响,进一步通过体内实验验证circrnf13对胰腺癌肿瘤生长的影响并使用免疫组化(IHC)检测瘤体组织中增殖相关标志物Ki67与PCNA的阳性率。利用CSCD,circinteractome,mi RDB,mi RTarbase,Target Scan等数据库预测circrnf13潜在结合的mi RNA及mi RNA的靶m RNA。通过基因本体论(Go Ontology,GO)与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析筛选胰腺癌中circrnf13可能涉及到的细胞功能与信号通路。通过双荧光素酶报告基因实验筛选与circrnf13结合的具体mi RNA,进一步通过回复实验验证靶mi RNA mi R-139-5p对circrnf13功能的影响。结合生物信息学分析,PCR与双荧光素酶报告基因实验筛选mi R-139-5p靶m RNA分子,通过功能实验验证靶m RNA IGF1R对mi RNA的回复作用。通过Western-blot实验验证circrnf13对IGF1R及其下游分子表达量的影响,结合PCR与Western-blot实验验证circrnf13与mi R-139-5p调控IGF1R及下游分子表达量的方式。进一步功能功能实验验证circrnf13/mi R-139-5p/IGF1R轴对胰腺癌增殖,侵袭,迁移与细胞周期的调控作用。结果:Sanger测序及PCR结果显示胰腺癌细胞中circrnf13有环形结构且在RNase R存在的环境中具有较高稳定性,RNA核浆分离及FISH实验显示circrnf13主要定位于胰腺癌细胞质中。功能实验结果显示circrnf13促进了胰腺癌细胞周期由G1向S期的转变及胰腺癌细胞的增殖,侵袭与迁移。体内实验结果显示circrnf13敲降后抑制了胰腺癌肿瘤生长。双荧光素酶报告基因结果显示circrnf13与mi R-139-5p相互结合,mi R-139-5p可以抑制circrnf13对胰腺癌细胞增殖,侵袭,迁移能力的影响及circrnf13对胰腺癌细胞周期的调控作用。PCR结果与双荧光素酶报告基因结果显示mi R-139-5p结合IGF1R m RNA并抑制其表达,功能实验结果显示IGF1R可回复mi R-139-5p在胰腺癌中的效应。Western-blot及PCR实验结果显示circrnf13可通过mi R-139-5p促进IGF1R及其下游分子的表达,后续功能实验结果显示circrnf13/mi R-139-5p/IGF1R轴增强了胰腺癌细胞增殖,侵袭与迁移能力,并促进了胰腺癌细胞周期由G1向S期的转变。结论:1.胰腺癌中circrnf13具有环形结构,且在胰腺癌组织中及细胞系中circrnf13表达均高于正常胰腺组织与细胞。2.circrnf13促进了胰腺癌细胞的增殖,侵袭,迁移及细胞周期由G1向S期的转变,在体内促进胰腺癌肿瘤生长。3.circrnf13通过mi R-139-5p/IGF1R轴增强胰腺癌细胞增殖,侵袭与迁移能力并参与胰腺癌细胞周期的调节。

关键词：胰腺癌 circrnf13 增殖侵袭细胞周期 miR-139-5p IGF1R

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