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新型阳离子类脂材料C1转染肿瘤抗原NY-ESO-1环状RNA刺激T细胞产生IFN-γ的比较研究

中华微生物学和免疫学杂志 2024年第9期44卷 771-777页

作者：周红马意朋汪晓娟刘凤兰李彬乔栋娟夏小俊任培根王明军深圳因诺免疫有限公司研究发展部，深圳　518119 中国科学院深圳先进技术研究院能量代谢与生殖研究中心，深圳　518055 中山大学肿瘤防治中心，华南肿瘤学国家重点实验室，广州　510060

目的:利用环状RNA(circular RNA，circrna)分子表达NY-ESO-1抗原表位，并利用一种新型类脂材料C1制备circrna肿瘤疫苗，初步评价其在细胞内的转染效率和对T细胞的激活情况。方法:体外转录合成表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluor... 详细信息

目的:利用环状RNA(circular RNA，circrna)分子表达NY-ESO-1抗原表位，并利用一种新型类脂材料C1制备circrna肿瘤疫苗，初步评价其在细胞内的转染效率和对T细胞的激活情况。方法:体外转录合成表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)和NY-ESO-1抗原表位的mRNA和circrna，并转染COS7细胞，体外检测目的蛋白的表达情况。利用C1材料和商用转染试剂TransIT-mRNA作为mRNA NY-ESO-1和circrna NY-ESO-1的递送系统制备疫苗，比较其转染效率。结果:mRNA EGFP、circrna EGFP体外转染COS7细胞24 h后，荧光显微镜下可见明显的EGFP表达。mRNA NY-ESO-1、circrna NY-ESO-1转染COS7-A*02：01细胞后可以刺激靶向NY-ESO-1/HLA-A2的T细胞受体工程化T细胞(T cell receptor-engineered T cells, TCR-T)分泌细胞因子IFN-γ。circrna NY-ESO-1能够更持久地表达目的抗原并刺激靶细胞释放IFN-γ，在体外对细胞株共培养的条件下，C1材料的递送效果较商用转染试剂好。结论:相较于线性mRNA，circrna转染COS7-A*02：01细胞后能够更有效、更持久地激活T细胞，未来可能是一种更适合用于临床治疗肿瘤的分子。类脂材料C1能够有效递送线性mRNA分子和circrna分子。本研究为circrna肿瘤疫苗的研究提供了新思路。

关键词：肿瘤疫苗 NY-ESO-1 circrna疫苗类脂材料C1 免疫治疗

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日本脑炎病毒RNA疫苗的构建与免疫原性研究

日本脑炎病毒RNA疫苗的构建与免疫原性研究

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作者：陈涛华中农业大学

学位级别：硕士

日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种人畜共患病病原,感染后可引起乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE),其病死率可达30%。除了对人类生命健康造成严重危害,JEV还可以感染猪,造成种猪的繁殖障碍,对生猪养殖行业造成重... 详细信息

日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种人畜共患病病原,感染后可引起乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE),其病死率可达30%。除了对人类生命健康造成严重危害,JEV还可以感染猪,造成种猪的繁殖障碍,对生猪养殖行业造成重大的经济损失。目前,市售的针对JEV的疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗,其中灭活疫苗具有多剂量接种导致的副作用大、免疫原性差等缺点,而减毒活疫苗具有毒株返强的潜在威胁性。因此,急需开发安全且具有良好免疫原性的新型JEV疫苗。E蛋白是JEV的囊膜糖蛋白,是诱导中和抗体的主要抗原蛋白,该蛋白的第三结构域(E domain III,EDⅢ)包含主要的中和表位。pr M蛋白对E蛋白的正确折叠、膜结合、组装是至关重要的,是病毒诱导保护性免疫的重要协同成分,因此pr M-E的融合蛋白可能更具有免疫优势。RNA疫苗如mRNA和circrna疫苗,相对于其他新型疫苗具有不整合到基因组、无抗载体免疫原性以及更易于高纯度生产等显著优势。因此,本研究分别以JEV的pr ME和EDⅢ作为抗原蛋白,开展mRNA与circrna疫苗的制备与免疫原性研究。具体研究内容如下:1.编码JEV pr M-E基因的mRNA疫苗的构建与抗原表达验证利用分子克隆技术在p GEM-3zf(+)载体中引入UTR、poly A、Kozak、以及信号肽等序列,并选择JEV的pr M和E基因作为抗原基因,构建了编码pr M-E基因的质粒p GEMIVT-pr M-E,并通过体外转录获得相应的mRNA(pr M-E-mRNA)。通过Western blot实验证明转染pr M-E-mRNA的HEK-293T细胞能够有效表达pr M和E蛋白,且能够分泌到上清。同时发现,修饰性核苷酸可以减少pr M-E-mRNA对细胞炎症反应的激活。最后借助微流控平台将脂质纳米颗粒(LNP)与pr M-E-mRNA混合,制备成LNP包裹的mRNA疫苗(LNP-pr M-E-mRNA)。*** LNP-pr M-E-mRNA疫苗的免疫原性及小鼠攻毒保护效果评价将LNP-pr M-E-mRNA疫苗对6周龄C57BL/6雌性小鼠进行肌肉注射免疫,并设置分别注射LNP、SA14-14-2减毒活疫苗以及DMEM的对照组。经过一次加强免疫后对小鼠进行采血,通过空斑减少中和试验测定中和抗体水平,结果显示,mRNA和减毒活疫苗免疫小鼠血清中和抗体水均明显提高。随后通过ELISA和流式细胞实验证明mRNA疫苗免疫小鼠血清中IFN-γ水平和脾脏CD8+T细胞数量均明显上升,证明mRNA疫苗也能激活细胞免疫反应。随后利用致死剂量的JEV强毒株对各组小鼠进行攻毒,结果显示,LNP和DMEM注射小鼠均在攻毒后5天左右出现典型的临床症状,且最终全部死亡,而mRNA和减毒活疫苗免疫小鼠仅表现轻微临床症状,且最终100%存活。并且,相比于LNP和DMEM注射小鼠,mRNA和减毒活疫苗免疫小鼠脑内病毒载量和炎性因子水平均显著下降,病理变化也明显缓解。这说明了以pr M-E为抗原蛋白的mRNA疫苗具有良好的免疫原性和攻毒保护效果。3.编码JEV EDⅢ的circrna的构建与抗原表达验证本研究将改造的鱼腥藻I类内含子作为环化策略,在pcircrna载体中引入IRES、间隔序列、Kozak序列构建高效的circrna载体。因考虑环化效率因素,我们选择序列较短,但包含较多中和表位的JEV EDⅢ作为抗原。通过甲醛变性凝胶、反转录、测序等方法证明编码JEV EDⅢ的circrna(EDⅢ-circrna)构建成功。随后,通过Western blot和间接免疫荧光实验验证了EDⅢ-circrna转染的HEK-293T细胞中有效表达了EDⅢ蛋白,并且该circrna具有良好的稳定性。最后将LNP与EDⅢ-circrna混合,制备成LNP包裹的circrna疫苗(LNP-EDⅢ-circrna)。*** LNP-EDⅢ-circrna疫苗的免疫原性及小鼠攻毒保护效果评价将LNP-EDⅢ-circrna疫苗对6周龄C57BL/6雌性小鼠进行肌肉注射免疫,并设置注射LNP和SA14-14-2减毒活疫苗的对照组。经过一次加强免疫后对小鼠进行采血,通过空斑减少中和试验测定其中和抗体水平,结果显示,减毒活疫苗免疫小鼠血清中和抗体水平显著提高,而circrna疫苗刺激的中和体上升水平相对较低。在攻毒保护实验中,LNP注射小鼠在攻毒后出现典型的临床症状并最终全部死亡,而circrna疫苗免疫小鼠整体的症状较LNP注射小鼠轻,最终存活率为40%。并且,相比于LNP注射小鼠,circrna疫苗免疫小鼠脑内病毒载量有一定的下降。上述结果表明该编码EDⅢ抗原的circrna疫苗仍然需

关键词：日本脑炎病毒 mRNA疫苗 circrna疫苗 prM-E蛋白 EDⅢ蛋白免疫原性保护效果

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RNA疫苗研究进展及狂犬病RNA疫苗

RNA疫苗研究进展及狂犬病RNA疫苗

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第21次全国犬业科技学术研讨会

作者：汪芋缪发明张守峰么乃全扈荣良吉林农业大学动物医学院中国农业科学院长春兽医研究所流行病学与病毒病防控实验室

狂犬病(rabies)是一种严重的急性人畜共患传染病,每年全球约6万人死于该病,其中亚洲和非洲发生最多。狂犬病病毒(rabies virus,RABV)是狂犬病的致病病原体,由结构蛋白和负链RNA构成。狂犬病一旦发病致死率为100%,目前疫苗接种仍是预防... 详细信息

狂犬病(rabies)是一种严重的急性人畜共患传染病,每年全球约6万人死于该病,其中亚洲和非洲发生最多。狂犬病病毒(rabies virus,RABV)是狂犬病的致病病原体,由结构蛋白和负链RNA构成。狂犬病一旦发病致死率为100%,目前疫苗接种仍是预防和控制狂犬病最为有效的策略。RNA疫苗是新一代核酸疫苗,其安全性好,有效性高,设计灵活,研发周期短,且借助高效递送系统,可刺激机体快速产生强烈免疫应答。RNA疫苗这一特点对于潜伏期短且病死率高的狂犬病的防控具有重要应用价值。本文对RNA疫苗及狂犬病RNA疫苗的研究进行系统梳理,以阐明其研究现状及应用前景。

关键词：狂犬病狂犬病病毒 saRNA疫苗 mRNA疫苗 circrna疫苗递送系统

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