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circpik3r1靶向mir-29a-3p调控糖尿病胰岛素抵抗的分子机制及异槲皮苷的作用

CircPIK3R1靶向miR-29a-3p调控糖尿病胰岛素抵抗的分子机制及异槲...

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作者：张传艺桂林医学院

学位级别：硕士

目的:本课题通过体内外实验探讨circpik3r1靶向mir-29a-3p调控糖尿病(diabetes mellitus,DM)胰岛素抵抗(insulin resistance,Ir)的分子机制及异槲皮苷的作用。方法:1.细胞实验首先利用生物信息学分析法预测circpik3r1与mir-29a-3p的结合位点、靶向关系,然后构建circpik3r1野生型(PGL3-circpik3r1 Wt)和突变型(PGL3-circpik3r1Mut)质粒,分别在HEK-293T和Hep G2细胞中与mir-29a-3p mimics共转染,用双荧光素酶检测法验证circpik3r1与mir-29a-3p靶向结合位点。构建circpik3r1(hsa-circ-0072746)过表达质粒,用QrT-PCr实验检测rNase r处理后Hep G2细胞中的circpik3r1与线性PIK3r1的表达情况以及胰岛素抵抗Hep G2细胞circpik3r1与mir-29a-3p的表达情况。用20μM异槲皮苷干预胰岛素抵抗Hep G2细胞circpik3r1转染或干预circpik3r1、mir-29a-3p共转染,48h后提取细胞培养上清,葡萄糖氧化酶实验检测葡萄糖消耗量;提取细胞总rNA和蛋白,QrT-PCr和Western blot法检测PI3K/AKT信号通路相关基因的m rNA和蛋白表达。2.动物实验构建circpik3r1(mmu-circ-0004400)过表达腺病毒,取SPF级雄性db/db小鼠(C57背景)18只,5周龄,分为糖尿病组、空载质粒腺病毒组以及circpik3r1过表达腺病毒组,每组6只,与同性别同周龄C57小鼠(视为正常组)6只处于同一条件下喂养。尾静脉注射空载质粒腺病毒于空载质粒腺病毒组小鼠体内,circpik3r1过表达腺病毒于腺病毒组小鼠体内。注射浓度均为1E+10PFU/m L,注射体积为200μL/只。14天后取各组小鼠肝组织采用QrT-PCr实验检测circpik3r1的表达情况。另取SPF级雄性db/db小鼠(C57背景)36只,7周龄,分为糖尿病组、空载质粒腺病毒组、circpik3r1过表达腺病毒组以及异槲皮苷低、中、高(20μM、40μM、80μM)剂量组,每组6只,与同性别同周龄C57小鼠6只处于同一条件下喂养。尾静脉注射浓度、体积与上批小鼠相同。14天后,异槲皮苷各组给予低、中、高剂量异槲皮苷灌胃,而非给药组相同条件下给予生理盐水,持续灌胃14后采血取材。罗氏血糖仪及配套试纸检测空腹血糖指标;ELISA方法检测血清空腹胰岛素含量;HE染色法和免疫组化法观察胰腺组织形态;QrT-PCr法检测circpik3r1、mir-29a-3p的表达情况。QrT-PCr法和Western blot法检测mir-29a-3p下游通路PI3K/AKT信号通路相关因子的m rNA和蛋白表达情况。结果:1.HEK-293T细胞或Hep G2细胞中,circpik3r1野生型与mir-29a-3p共转染细胞中的荧光活性明显降低(Pcircpik3r1突变型与mir-29a-3p共转染细胞中荧光活性没有显著变化(P>0.05)。2.胰岛素抵抗Hep G2细胞中,与对照组相比,circpik3r1表达明显降低而mir-29a-3p表达明显增加(P3.异槲皮苷干预circpik3r1转染、干预circpik3r1与mir-29a-3p共转染胰岛素抵抗Hep G2细胞,与模型组比较,显著提高胰岛素抵抗Hep G2细胞的葡萄糖消耗量(Pr-29a-3p的表达及上调Ins r、PI3K、AKT,下调FOXO1、PEPCK、G6Pase的m rNA表达(Pr、p-PI3K、p-AKT,下调FOXO1、PEPCK、G6Pase的蛋白表达(Pcircpik3r1过表达腺病毒后,经灌胃给药14天,与模型组比较,低、中、高剂量异槲皮苷组空腹血糖显著降低(Pr蛋白阳性染色减少,而FOXO1、PEPCK蛋白阳性染色明显增加(Pr蛋白阳性染色增多,而FOXO1、PEPCK蛋白阳性染色明显减少(Pr、PI3K、AKT,下调FOXO1、PEPCK、G6Pase的m rNA表达(P<0.05或P<0.01);上调

关键词：异槲皮苷 circpik3r1 mir-29a-3p 胰岛素抵抗

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