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Effect of lentiviral expression of circlifr on the biological behavior of Hep3B hepatocellular carcinoma cells

Journal of Hainan Medical University 2022年第24期28卷 14-18页

作者： LI Chen LIU Lu-zheng LU Han-yuan CHEN Jia-cheng CHEN Liang WU Jin-cai Clinical College of Hainan Medical University Haikou 571199China Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery Hainan Affiliated Hospital of Hainan Medical University(Hainan General Hospital)Haikou 570311China

Objective:To investigate the effect of lentiviral stable high expression of circlifr on the biological behavior of Hep3B hepatocellular carcinoma(HCC)***:Hep3B cell lines were infected with lentiviral packaging of circlifr expression plasmids to construct stable circlifr high expression HCC *** lentivirus infected with circlifr high expression sequence was used as the circlifr high expression group,the lentivirus infected with circlifr high expression empty vector sequence was used as the negative control group,and the uninfected group was used as the blank control *** that,circlifr expression levels were detected by qPCR,and the back splice sites were identified by Sanger *** cell viability was examined by cell proliferation kit and invasive ability was determined by Transwell ***:The qPCR and Sanger sequencing showed that the stable circlifr expression of Hep3B cells was successfully *** circlifr high expression group had better cell proliferation viability than the negative control and blank control groups,and the differences were statistically significant(Pcirclifr high expression group was(396.6±32.9),and the differences were statistically significant(Pcirclifr expression considerably promotes the proliferation and invasive ability of Hep3B cells.

关键词： Circular RNA circlifr Hepatocellular carcinoma Biological behavior

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环状RNA circlifr在非小细胞肺癌中的功能及作用机制研究

环状RNA circLIFR在非小细胞肺癌中的功能及作用机制研究

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作者：江美娜宁波大学

学位级别：硕士

背景及意义非小细胞肺癌（non-small cell lung caner,NSCLC）是肺癌的主要类型,其发病率和致死率居恶性肿瘤前列。尽管靶向治疗和免疫治疗在NSCLC中取得了进步,但患者的五年生存率仍较低,总体预后较差。因此,为了降低巨大的发病率和死... 详细信息

背景及意义非小细胞肺癌（non-small cell lung caner,NSCLC）是肺癌的主要类型,其发病率和致死率居恶性肿瘤前列。尽管靶向治疗和免疫治疗在NSCLC中取得了进步,但患者的五年生存率仍较低,总体预后较差。因此,为了降低巨大的发病率和死亡率,迫切需要探索NSCLC的新靶点和新型标志物,以及阐明NSCLC发生发展的分子机制。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类主要由外显子反向剪接产生的非编码的环形RNA分子,通过调节转录、充当microRNA诱饵、蛋白质支架,竞争结合蛋白质等多种形式参与细胞增殖和肿瘤发生进程。但与NSCLC发生发展相关的新型circRNA,及其竞争性内源RNA（competiting endogenous RNA,ceRNA）作用机制仍不清楚。本研究利用circRNA表达芯片筛选出肺癌相关的circlifr,分析其和临床病理因素的潜在关系,研究其对癌细胞生长、增殖、凋亡以及周期的影响,明确circlifr通过与抑癌基因PTEN竞争结合miR-1305进而影响下游PI3K/AKT通路,阐明circlifr在NSCLC中的功能和作用机制,为探寻新型诊断标志物、预后生物标志物和分子治疗靶点提供理论基础。方法（1）通过GEO数据库获得NSCLC患者circRNA表达芯片数据（GSE126533）,以及正常肺上皮细胞（BEAS-2B）和两株NSCLC细胞（A549,HCC827）的测序数据（GSE152434）,按照Pvalue2,排行前100名,未有文章发表,与肿瘤生长增殖相关,表达丰度最高,初步选定circlifr（hsairc072298）作为研究目的分子。（2）设计背靠背引物特异性扩增成环位点、RNaseR消化以及放线菌素D处理验证circlifr的环形结构和稳定性。RT-qPCR检测circlifr在NSCLC细胞中的表达,核质分离实验检测circlifr的亚细胞定位。RT-qPCR检测circlifr在NSCLC患者中的表达情况,通过卡方分析明确circlifr与临床病理特征的潜在关系。（3）构建circlifr的过表达质粒和合成siRNA:向NSCLC细胞中转染过表达质粒和siRNA,通过MTT、克隆形成、流式细胞术等方法分别检测circlifr对NSCLC细胞生长、增殖和细胞凋亡的影响。（4）数据库预测与circlifr潜在结合的miR-1305。敲低和过表达circlifr后RT-qPCR检测miR-1305的表达。双萤光素酶报告基因实验检测circlifr与miR-1305的结合位点。RT-qPCR检测NSCLC组织中miR-1305的表达丰度。皮尔森相关性分析明确circlifr与miR-1305在NSCLC组织中的相关性。（5）共转染过表达circlifr质粒和miR-1305,通过MTT、克隆形成、流式细胞术等方法检测circlifr回复miR-1305的细胞生物学功能。（6）双萤光素酶实验验证miR-1305与PTEN之间的靶向结合关系。Western Blot分析circlifr对PTEN下游的PI3K/AKT的调控作用。结果（1）Hsairc072298在NSCLC芯片中显著低表达,是LIFR产生的表达丰度最高的环形转录本。背靠背引物仅能扩增包含成环位点的目的片段,circlifr耐受RNase R消化和放线菌素D干扰。（2）circlifr在NSCLC细胞中低表达,主要定位于细胞质中。circlifr在NSCLC组织中显著低表达,在肺癌患者全血中显著高表达,并且和肿瘤大小、单发多发、分化程度和病理类型相关。（3）过表达circlifr可显著抑制NSCLC细胞的生长、增殖和促进细胞的凋亡。敲低circlifr表达可显著促进NSCLC细胞的生长、增殖和抑制细胞的凋亡。circlifr的变化对细胞周期没有影响。（4）circlifr与miR-1305存在直接的靶向关系,miR-1305在NSCLC中显著上调,且与circlifr的表达呈负相关。circlifr可以回复miR-1305促进NSCLC细胞生长增殖的作用,以及回复miR-1305抑制细胞凋亡的作用。（5）MiR-1305与PTEN 3'UTR存在直接靶向关系,circlifr可以回复miR-1305对PTEN的抑制。circlifr通过与PTEN竞争结合miR-130形成调节轴,从而影响下游PI3K/AKT中AKT的磷酸化。结论（1）肺癌相关的circlifr具有稳定的环形结构,在NSCLC细胞中低表达,主要定位于细胞质中。circlifr在NSCLC组织中低表达,且与肿瘤大小、病灶单发多发情况、肿瘤分化程度和病理类型有关。全血circlifr能用来区分健康人、良性肺

关键词：环状RNA circlifr miR-1305 磷酸酶及张力蛋白同源的基因非小细胞肺癌

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慢病毒表达circlifr对Hep3B肝癌细胞生物学行为的影响

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海南医学院学报 2022年第24期28卷 1855-1859,1866页

作者：李辰刘路政卢汉原陈家诚陈良武金才海南医学院临床学院海南海口571199 海南医学院附属海南医院(海南省人民医院)肝胆胰外科海南海口570311

目的:探讨慢病毒稳定高表达circlifr对Hep3B肝癌细胞生物学行为的影响。方法:通过慢病毒包装circlifr表达质粒,感染Hep3B细胞以构建稳定circlifr高表达的肝癌细胞株。其中构建肝癌Hep3B细胞株感染circlifr高表达序列的慢病毒为circlifr... 详细信息

目的:探讨慢病毒稳定高表达circlifr对Hep3B肝癌细胞生物学行为的影响。方法:通过慢病毒包装circlifr表达质粒,感染Hep3B细胞以构建稳定circlifr高表达的肝癌细胞株。其中构建肝癌Hep3B细胞株感染circlifr高表达序列的慢病毒为circlifr高表达组,感染circlifr高表达空载体序列的慢病毒为阴性对照组,无感染组为空白对照组。qPCR检测circlifr的表达,Sanger测序鉴定其环状拼接位点。细胞增殖试剂盒检验细胞活力,Transwell鉴定侵袭能力。结果:qPCR和Sanger测序显示成功建立circlifr稳定表达细胞株。circlifr高表达组细胞增殖活力优于阴性对照组以及空白对照组,差异具有统计学意义(Pcirclifr高表达组穿透Matrigel滤膜的细胞数为(396.6±32.9)个,差异具有统计意义(Pcirclifr高表达明显提高Hep3B肝癌细胞增殖活力,促进细胞侵袭。

关键词：环状RNA circlifr 肝癌生物学行为

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