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circ-MYOCD参与心肌肥厚的功能与机制研究

Circ-MYOCD参与心肌肥厚的功能与机制研究

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作者：杨静宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的:心肌肥厚是一种适应性心脏反应,但随着负荷持续加重,久而久之会引起失代偿性的心肌肥厚、心力衰竭甚至猝死。环状RNA(circRNA)作为一种特殊的非编码RNA,在心肌肥厚、心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病中发挥重要作用;近年来,越... 详细信息

目的:心肌肥厚是一种适应性心脏反应,但随着负荷持续加重,久而久之会引起失代偿性的心肌肥厚、心力衰竭甚至猝死。环状RNA(circRNA)作为一种特殊的非编码RNA,在心肌肥厚、心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病中发挥重要作用;近年来,越来越多的研究发现心肌肥厚与circRNA异常表达之间存在潜在的联系。本课题主要探讨circmyocd在心肌肥厚中的功能和机制,为抑制心肌肥厚和心衰发展等方面研究提供新的方向。第一部分:circRNAs在心肌肥厚中的异常表达方法:(1)构建SD乳鼠原代心肌细胞肥大模型(2)查阅文献确定了16个候选分子,sanger测序验证circRNAs的成环性。(3)RNase R酶检测circRNAs的富集水平。(4)qRT-PCR检测circRNAs的表达水平(5)心肌细胞总RNA核质分提后,qRT-PCR检测circRNAs的核质分布。(6)NCBI官网查询circRNAs在人组织中的表达分布情况。(7)提取SD大鼠各组织总RNA,将PCR扩增产物跑琼脂糖凝胶电泳,得到circmyocd在不同组织的分布情况。结果:(1)通过检测心肌肥厚分子标志物,确认心肌肥厚模型构建成功。(2)Sanger测序确认了circRNAs通过反向剪接成环。(3)RNase R酶消化线性RNA后可以富集到大部分circRNAs。(4)circ-MYOCD、circ-FAM208A、circ-ANKIB1、circ-PRDM5、circPLCL2、circ-VMP1、circ-TBCEL和circ-PALLD的表达水平在心肌细胞肥大模型中有显著变化。(5)除circ-CACNA1C外,其余circRNAs主要分布于细胞质中。(6)circ-PALLD、circ-MYOCD和circ-PLCL2在人心肌组织中表达相对特异,其中circ-PALLD的表达丰度最高,circ-MYOCD次之,但circ-PALLD的CT值过高,故将候选分子确定为circmyocd。(7)circ-MYOCD在大鼠组织中呈心肌特异性表达。第二部分:circ-MYOCD在心肌肥厚中的作用方法:(1)设计并合成针对circ-MYOCD的siRNA和过表达腺病毒,转染原代心肌细胞,检测敲减和过表达效率。(2)qRT-PCR技术检测敲减或过表达circ-MYOCD后对心肌肥厚分子标志物的影响。(3)细胞免疫荧光技术检测敲减或过表达circ-MYOCD后对心肌细胞表面积的影响。结果:(1)在原代心肌细胞中转染针对circ-MYOCD的siRNA可以将circ-MYOCD的表达水平敲减70%左右,感染过表达腺病毒可以将其表达水平上调约8倍。(2)敲减circ-MYOCD后ANP和MYH7的表达水平上调,MYH6的表达水平下调;过表达circmyocd后其表达水平与之相反。(3)敲减circ-MYOCD后心肌细胞表面积增加,过表达circ-MYOCD可以减小心肌细胞的大小。第三部分:circ-MYOCD在心肌肥厚中的机制研究方法:(1)RNA pull down富集与circ-MYOCD相互作用的RNA结合蛋白,进行银染鉴定和质谱分析。(2)Clue GO做富集分析,并应用western blot验证。结果:(1)RNA pull down富集下来的蛋白主要集中于非折叠蛋白、对过氧化氢的反应蛋白、延伸因子活性翻译蛋白及钙依赖性磷脂结合蛋白等,尤其是非折叠蛋白呈高度富集。Clue GO分析非折叠蛋白的富集情况,发现主要集中于分子伴侣家族中的分子伴侣素(CCT)家族和热休克蛋白(HSP)家族。(2)Western blot结果显示,circ-MYOCD敲减后,CCT家族中的TCP1、CC3、CC4,以及HSP家族中的HSP27、P-HSP27、HSPA9、GRP78和HSP90B1的表达水平均下调,反之,过表达circ-MYOCD后其表达水平均上调。结论:在大鼠原代心肌细胞肥大模型中,发现多种circRNAs的表达水平异常,通过实验进一步筛选,最终将研究对象确定为circ-MYOCD。它在心肌组织中特异性表达,主要分布在细胞质中,通过外显子2和外显子5的反向剪接成环,对核糖核酸外切酶耐受,且在PE和AngⅡ诱导的肥大模型中表达水平显著下降。为进一步研究circ-MYOCD在心肌肥厚中的功能,我们敲减circ-MYOCD,发现可以加重心肌细胞的肥大,反之,过表达circ-MYOCD可以抑制心肌细胞肥大。我们通过RNA pull down富集与circ-MYOCD相互作用的RBP,并应用western blot验证,结果显示敲减circ-MYOCD后,会导致CCT家族和HSP家族的蛋白表达水平降低。因此,circ-MYOCD下调诱导的心肌肥大可能是通过CCT家族和HSP家族等非折叠蛋白的异常表达所调控的。

关键词：环状RNA circ-MYOCD 心肌细胞心肌肥厚 RNA结合蛋白

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