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circ-0005077/miR-200b-3p/FN1在电离辐射诱导肺上皮细胞上皮间充质转化（EMT）中的作用及机制研究

circ-0005077/miR-200b-3p/FN1在电离辐射诱导肺上皮细胞上皮间充...

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作者：蓝挺曦苏州大学

学位级别：硕士

目的通过筛选放射工作人员转录组筛选差异表达基因与非编码RNA,结合生物信息学分析,得出与电离辐射诱发肺上皮细胞EMT相关的circRNA/miRNA/mRNA轴向调控通路,探讨该通路在电离辐射导致肺上皮细胞上皮间充质转化(EMT)中的作用和分子机制... 详细信息

目的通过筛选放射工作人员转录组筛选差异表达基因与非编码RNA,结合生物信息学分析,得出与电离辐射诱发肺上皮细胞EMT相关的circRNA/miRNA/mRNA轴向调控通路,探讨该通路在电离辐射导致肺上皮细胞上皮间充质转化(EMT)中的作用和分子机制。方法1.对某单位放射工作人员血液样本进行RNA-seq转录组学检测,获取RNA-seq结果,通过生物信息学分析筛选差异表达mRNA、circRNA和关联miRNA,构建circRNA/miRNA/mRNA轴向调控通路。2.用X射线辐照仪对C57BL/6J(C57)雄性小鼠进行多次照射,单次剂量为0.1Gy,剂量率为0.1Gy/min,每10天照射一次,200天内累积剂量为2Gy。收集小鼠肺组织,进行病理学检测、Masson染色、MDA和Western Blot实验,观察放射性肺纤维化和肺上皮细胞EMT的发生。3.用X射线辐照仪对人肺上皮细胞(BEAS-2B)进行多次照射,单次照射剂量为0.5Gy,剂量率为1.22Gy/min,累积剂量为2Gy。收集细胞样本,用Western Blot、划痕实验、细胞粘附性实验、CCK-8活性实验和细胞衰老实验等来观察EMT的发生。***实验检测FN1、miR-200b-3p、circ-0005077在肺上皮细胞中的表达,荧光素酶报告基因检测miR-200b-3p/FN1以及circ-0005077/miR-200b-3p之间的靶调控关系。肺上皮细胞中,分别过表达miR-200b-3p和抑制circ-0005077表达,收集细胞样本,用Western Blot检测FN1以及EMT标志物的表达改变,并用细胞粘附性实验、CCK-8活性实验验证受照细胞的EMT改变。结果1.转录组结果显示,照射组与对照组存在874个差异表达mRNA,肺部疾病组与对照组存在1492个差异表达mRNA,这两组差异mRNA中存在100个共同的差异mRNA。从GEO数据库中检索到可能参与EMT调控的差异miRNA共146个,其中90个下调,56个上调。转录组结果显示,照射组与对照组一共有1149个差异表达circRNA,其中639个表达上调,510个表达下调。生物信息学预测miR-200b-3p与FN1存在结合位点,circ-0005077与miR-200b-3p存在结合位点,推测存在circ-0005077/miR-200b-3p/FN1轴向调控通路。2.小鼠肺部在完成2Gy照射24h后出现肺部炎症、纤维沉积以及氧化应激水平升高,钙粘连蛋白(E-cad)表达降低,波形蛋白(Vimentin)、Snail表达增高,表明小鼠肺部出现放射性肺纤维化和肺上皮EMT的发生。3.人肺上皮细胞(BEAS-2B)完成2Gy照射24h后出现增殖能力上升、衰老细胞减少、黏附率下降、迁移能力上升,E-cad表达降低,纤维连接蛋白(FN1)和肌动蛋白(α-SMA)表达上升,发生EMT。4.荧光素酶报告显示 FN1/miR-200b-3p 以及 miR-200b-3p/circ-0005077 存在靶向调控。发生EMT的细胞中,FN1和circ-0005077基因表达水平上升,miR-200b-3p表达水平降低。过表达miR-200b-3p细胞受照后,细胞增殖能力下降,黏附能力升高,FN1表达水平降低,Vimentin、α-SMA、Snail表达降低,EMT被抑制。抑制circ-0005077表达细胞受照后,细胞增殖能力下降,黏附能力升高,FN1表达水平降低,Vimentin、α-SMA表达降低,EMT被抑制。结论circ-0005077/miR-200b/FN1调控通路通过调节EMT过程参与放射性肺纤维化的形成,并可作为放射性肺纤维化诊断和防治的潜在靶点。

关键词：电离辐射肺上皮细胞 EMT FN1 circ-0005077 miR-200b-3p

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