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右美托咪定对肺缺血/再灌注损伤小鼠内质网应激相关分子caspase-12表达的影响

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中国应用生理学杂志 2016年第2期32卷 164-168,I0003页

作者：罗梓垠郭长满项冰倩宋冬陈丹应磊邱晓晓王万铁温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所浙江温州325035

目的:探讨右美托咪定(DEX)对肺缺血/再灌注(I/R)损伤小鼠内质网应激(ERS)相关分子天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(caspase-12)表达的影响。方法:选用C57BL/6J小鼠复制在体左肺原位I/R损伤模型。随机将40只小鼠分为4组(n=10):假手术组(... 详细信息

目的:探讨右美托咪定(DEX)对肺缺血/再灌注(I/R)损伤小鼠内质网应激(ERS)相关分子天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(caspase-12)表达的影响。方法:选用C57BL/6J小鼠复制在体左肺原位I/R损伤模型。随机将40只小鼠分为4组(n=10):假手术组(sham组),I/R损伤组(I/R组),生理盐水对照组(NS组),右美托咪定干预缺血/再灌注组(DEX组)。DEX组在夹闭小鼠左肺门30 min前经腹腔注射DEX 25μg/kg,NS组为用同DEX组等体积的生理盐水替代DEX,其余操作同DEX组。3 h肺再灌注结束后,留取左肺。测定肺组织湿/干重比(W/D)及总肺含水量(TLW),光镜观察肺组织形态学改变,对肺组织进行损伤评估(IQA)。原位末端标记(TUNEL)法检测组织细胞凋亡指数(AI),蛋白免疫印迹法(Western blot)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测caspase-12、葡萄糖调节蛋白78(grp78)蛋白和mRNA表达水平。结果:与sham组比,I/R组和NS组肺W/D、TLW、IQA、AI均明显升高(Pcaspase-12、grp78蛋白和mRNA表达量增加(Pcaspase-12、grp78蛋白和mRNA表达量无明显差异(P>0.05)。DEX组与I/R组比,W/D、TLW、IQA和AI均有下降(Pcaspase-12和grp78蛋白和mRNA表达量下降(Pcaspase-12引起的细胞凋亡有关。

关键词： caspase-12 右美托咪定缺血/再灌注肺内质网应激小鼠

晚期糖基化白蛋白通过激活caspase-12途径诱导巨噬细胞凋亡

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生理学报 2016年第6期68卷 733-739页

作者：李金国郝奇刘映雪李鹏邵夏炎田华方永奇姚树桐泰山医学院基础医学院泰安271000 泰山医学院人口与计划生育学院泰安271000 泰山医学院动脉粥样硬化研究所泰安271000

本文旨在研究晚期糖基化白蛋白(advanced glycated albumin,AGE-alb)对巨噬细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)凋亡途径关键分子caspase-12的影响,以阐明AGE-alb对巨噬细胞凋亡的诱导作用及机制。体外培养RAW264.7巨噬细胞,分别给予AGE-alb(2、4和6 g/L)、正常对照白蛋白(control albumin,C-alb,4 g/L)、ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM,4 mg/L)处理,或以ERS抑制剂4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA,5 mmol/L)预处理细胞1 h,然后与AGE-alb(4 g/L)共孵育24 h。采用MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡情况,试剂盒测定培养基乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,免疫印迹法检测caspase-12表达变化。结果显示:与TM相似,AGE-alb显著诱导RAW264.7巨噬细胞损伤,表现为细胞活力降低,LDH漏出和细胞凋亡率明显增加,且呈浓度依赖性。AGE-alb明显上调caspase-12活性,尤其在4和6 g/L浓度时更为显著(Pcaspase-12活化(Pcaspase-12介导的ERS凋亡途径有关。

关键词：晚期糖基化白蛋白内质网应激 caspase-12 巨噬细胞凋亡

caspase-12和m-Calpain蛋白及mRNA在COPD模型大鼠膈肌和趾长伸肌中表达的研究

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Caspase-12和m-Calpain蛋白及mRNA在COPD模型大鼠膈肌和趾长伸肌...

作者：王富霞郑州大学

学位级别：硕士

研究背景和目的慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）以气流受限为特征，是可以预防、可以治疗的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COP... 详细信息

研究背景和目的慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）以气流受限为特征，是可以预防、可以治疗的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD不但导致肺部疾病，而且还累及心血管、骨骼肌、骨骼、消化等多系统的全身性疾病[1]。骨骼肌萎缩在COPD患者发生率达20%-40%，不仅增加COPD患者死亡率[2]，还严重影响疾病预后。最近研究示，在骨骼肌萎缩中骨骼肌细胞过度凋亡起重要作用[3-4]，而肌纤维蛋白降解也起一定作用[5]，说明细胞凋亡在骨骼肌萎缩机制中发挥重要作用，作为半胱氨酸蛋白酶家族一员，caspases是细胞凋亡分子机制中重要的效应子。骨骼肌细胞凋亡的增加，导致肌纤维数量减少，引起COPD患者骨骼肌萎缩和体重减轻[6]。实验发现严重烧伤大鼠、失神经支配大鼠引起的骨骼肌萎缩均伴细胞凋亡增加[7-8]。内质网途径是细胞凋亡信号传导途径之一，caspase-12存在于内质网，在内质网应激诱导凋亡过程中发挥重要作用[9]。m-Calpain是Ca2+依赖的中性半胱氨酸蛋白酶，存在于哺乳动物细胞和组织中，被激活后可以激活caspase-12[10-11]，最终引起一系列细胞凋亡。KalaiM证明caspase-12主要在肺部和骨骼肌表达[12]。已有研究表明内质网应激途径在老年大鼠骨骼肌萎缩中起重要作用[13]，内质网凋亡中的重要因子caspase-12是否参与COPD大鼠骨骼肌（膈肌和趾长伸肌）萎缩，m-Calpain是否通过激活caspase-12参与其中？因此我们拟定本课题，通过COPD大鼠模型，检测大鼠膈肌和趾长伸肌细胞凋亡率、膈肌和趾长伸肌中caspase-12和m-Calpain蛋白及mRNA的表达，以及caspase-12和m-Calpain相关性，初步探讨caspase-12和m-Calpain是否参与COPD大鼠膈肌和趾长伸肌萎缩过程，m-Calpain是否是通过激活caspase-12参与其中？材料与方法按照随机数字表，把40只健康成年雄性Wistar大鼠分为两组，对照组和模型组，每组各20只。模型组按照以下方法造模：实验第1～29天、31～60天，将大鼠置于密闭染毒箱（自制）内被动吸入香烟烟雾，每日两次，每次30分钟，间隔时间8小时，持续2个月。第30天模型组大鼠气管内注入PPE，对照组大鼠以相同方式同时注入等量注射用生理盐水，余不做处理。第60天，在每组中随机选取10只大鼠进行肺功能检测;第61天处死全部大鼠，取肺组织、膈肌及双侧趾长伸肌，并将膈肌和右侧趾长伸肌称重后进行如下测定：1、TUNEL法检测膈肌和趾长伸肌细胞凋亡率;2、肺组织、膈肌和趾长伸肌组织作病理切片HE染色;3、免疫组织化学法检测膈肌和趾长伸肌中caspase-12和m-Calpain蛋白的表达;4、聚合酶链式反应（RT-PCR）检测膈肌和趾长伸肌中caspase-12和m-CalpainmRNA的表达;结果1、肺功能结果示：模型组大鼠PEF、FEVO.3和FEVO.3/FVC%均显著降低，提示存在小气道阻力增加和阻塞性通气功能障碍现象。2、TUNEL法检测示：COPD模型大鼠膈肌和趾长伸肌细胞凋亡率均较正常组明显增加（P＜0.05），提示模型组大鼠膈肌、趾长伸肌组织中存在细胞凋亡。3、肺组织病理切片示：模型组大鼠肺组织出现慢性非特异性炎症及肺气肿现象，符合COPD肺组织病理学变化特点。4、膈肌和趾长伸肌病理组织切片示：模型大鼠膈肌和趾长伸肌的肌纤维发生断裂、溶解、坏死及萎缩现象。5、膈肌和趾长伸肌重量与其凋亡率分别呈负相关（r=-0.852，r=-0.844）。6、免疫组织化学结果显示：与对照组比较，caspase-12蛋白在模型组大鼠膈肌、趾长伸肌中表达均有显著差异（P＜0.05），m-Calpain蛋白在模型组大鼠膈肌和趾长伸肌中的表达亦显著增强（P＜0.05），差异具有统计学意义。膈肌和趾长伸肌中caspase-12和m-Calpain蛋白均呈正相关（r=0.885，r=0.862）。7、RT-PCR法检测结果示：与对照组比较，模型组大鼠膈肌中caspase-12和m-Calpain mRNA的表达显著增强，有统计学意义（P＜0.05），模型组大鼠趾长伸肌中caspase-12和m-Calpain mRNA的表达也显著增强，差异有统计学意义。膈肌和趾长伸肌中caspase-12和m-Calpain mRNA均呈正相关（r=0.787，r=0.774）。结论模型组大鼠膈肌和趾长伸肌存在细胞凋亡及肌萎缩;膈

关键词：慢性阻塞性肺疾病细胞凋亡膈肌趾长伸肌萎缩 caspase-12 m-Calpain

caspase-12在扁平苔藓皮损中的表达及意义

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Caspase-12在扁平苔藓皮损中的表达及意义

作者：简晓清吉林大学

学位级别：硕士

扁平苔藓是一种临床上常见的慢性或者亚急性炎症性疾病，临床表现为紫红色或者肤色的扁平丘疹为主，伴有鳞屑;组织病理具有特征性，主要表现为表皮角化过度、基底细胞液化变性、真皮乳头层有胶样小体。扁平苔藓发病机制目前尚未完全清... 详细信息

扁平苔藓是一种临床上常见的慢性或者亚急性炎症性疾病，临床表现为紫红色或者肤色的扁平丘疹为主，伴有鳞屑;组织病理具有特征性，主要表现为表皮角化过度、基底细胞液化变性、真皮乳头层有胶样小体。扁平苔藓发病机制目前尚未完全清楚，研究显示更倾向于针对基底细胞的自身免疫学说，涉及细胞凋亡等。凋亡信号传递至caspase并使其活化，致使蛋白底物裂解、细胞解体，细胞凋亡得以完成。caspase-12是caspase大家族中一个目前只能在豚鼠中克隆的结构保守的特殊成员，作用机制尚处于研究阶段，研究认为caspase-12是内质网途径得以顺利进行的关键蛋白，通过caspase-12的活化，带动caspase家族的联级活化反应，关系复杂，最终能引起caspase-3的活化，预示着细胞凋亡进入不可逆阶段。扁平苔藓中细胞凋亡途径复杂，目前研究较多的是线粒体损伤途径和死亡受体途径，而针对内质网应激途径较少，但其在扁平苔藓的皮损区的作用仍值得研究。本实验试通过检测caspase-12在扁平苔藓皮损中的表达情况，并与正常皮肤相比较，以推测caspase-12在扁平苔藓发病中可能起的作用。目的:探讨caspase-12在扁平苔藓发病中可能起的作用，丰富疾病发病机制的理论基础，为临床治疗提供新的思路。方法：实验组30例，选取对象为吉林大学第二医院皮肤科收治患者的病变皮肤;对照组8例，选取对象为吉林大学第二医院普通外科手术患者的正常皮肤。采用免疫组织化学方法对标本进行检测，再通过统计方法比较其表达及意义。结果:在30例实验组中caspase-12均为阳性表达，并分布于全层;其中强阳性22例，5例阳性，3例弱阳性;caspase-12的表达主要见于基底层、棘层，尤以棘层多见。8例对照组中，caspase-12在也表达于正常皮肤组织，呈弱阳性表达，主要集中在基底层，胞质有散在颗粒。caspase-12在扁平苔藓皮损中的表达水平高于在正常对照组皮肤组织中的表达水平，二者差异经统计学分析具有显著统计学意义(pcaspase-12在大多数正常皮肤组织基底层中少有表达，呈弱阳性表达，它可能参与角质形成细胞的正常分化。2、caspase-12在扁平苔鲜皮损区表皮全层呈阳性表达，而且caspase-12的在扁平苔鲜表皮中的表达水平明显高于正常皮肤组织，caspase-12的表达主要见于基底层、棘层，尤以棘层多见，它可能参与扁平苔藓的发病。

关键词：扁平苔藓细胞凋亡 caspase-12

辛伐他汀通过caspase-12活化途径诱导K562细胞凋亡的实验研究

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四川大学学报（医学版） 2008年第6期39卷 900-904页

作者：胥国强蒲泽宴刘华杨永长黄文芳遂宁市人民医院检验科遂宁629000 四川省医学科学院四川省人民医院检验科

目的探讨caspase-12在辛伐他汀诱导K562细胞凋亡中的作用。方法在K562细胞培养液中分别加入毒胡萝卜素(阳性对照组)和辛伐他汀10、20、30μmol/L(辛伐他汀组)培养72 h,采用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态变化,Annexin-FITC/PI双染法检测... 详细信息

目的探讨caspase-12在辛伐他汀诱导K562细胞凋亡中的作用。方法在K562细胞培养液中分别加入毒胡萝卜素(阳性对照组)和辛伐他汀10、20、30μmol/L(辛伐他汀组)培养72 h,采用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态变化,Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+浓度,RT-PCR检测GRP78、Calpain基因mRNA表达水平,Western blot检测GRP78、caspase-3,-6,-7,-9,-12蛋白水平。结果10、20、30μmol/L辛伐他汀作用K562细胞72 h后,细胞出现典型的凋亡形态,凋亡率分别为12.41%±0.32%、19.08±0.26%、23.41±0.36%;细胞内Ca2+浓度增加,荧光强度分别为43±2.9、54±2.7、64±2.6;GRP78、Calpain基因mRNA表达上调;Western blot检测显示:caspase-3,-6,-7,-9,-12剪切活化,GRP78表达增强。结论caspase-12作为细胞凋亡的重要途径参与了辛伐他汀诱导K562细胞的凋亡。

关键词：辛伐他汀 caspase-12 K562细胞凋亡

Effects Of ATP Sensitive potassium channel opener on the mRNA and pro- tein expressions of caspase-12 after cerebral ischemia-reperfusion in rats

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Neuroscience Bulletin 2008年第1期24卷 7-12页

作者： Hong ZHANG Li-Chun SONG Chun-Hong JIA Yong-Li LU Department of Neurology the Affiliated Shengjing Hospital of China Medical University Shenyang 110004 China Department of Anatomy China Medical University Shenyang 110001 China

Objective To investigate effects of K_ATP opener on the expressions of caspase-12 mRNA and protein, and to explore the role of endoplasmic reticulum （ER） stress pathway in the mechanism of K_ATP opener protecting against neuronal apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion. Methods Two hundred rats were randomly divided into four groups： sham operation group, ischemia-reperfusion group, K_ATP opener group, and K_ATP blocker group. The middle cerebral artery occlusion （MCAO） model was established by intraluminal suture occlusion method; neuronal apoptosis was detected by TUNEL staining. The mRNA and protein expressions of caspase-12 were detected by semi-quantitative RT-PCR and immunohisto-chemical staining, respectively. Results In ischemia-reperfusion group, K_ATP opener group and K_ATP blocker group, the number of apoptotic cells and the mRNA and protein expressions of caspase-12 gradually increased following cerebral reperfusion, and reached the peak at 24 h. In K_ATP opener group, The number of apoptotic cells was significantly less than that in ischemia-reperfusion group and K_ATP blocker group at 12 h, 24 h, 48 h and 72 h （P 〈 0.05 or P 〈 0.01）; while the mRNA and protein levels of caspase-12 were significantly less than those in ischemia-reperfusion group and K_ATP blocker group at all times （P 〈 0.05 or P〈0.01）. There were no differences between the ischemia-reperfusion group and K_ATP blocker group at each time （P〉 0.05）. Conclusion K_ATP opener may protect neurons from apoptosis following the cerebral ischemia-reperfusion by inhibiting ER stress pathway.

关键词： ATP sensitive potassium channel cerebral ischemia apoptosis endoplasmic reticulum caspase-12

内质网应激中caspase-12的核心作用

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基因组学与应用生物学 2017年第9期36卷 3748-3753页

作者：谢羽孙警辉伍春莲西华师范大学生命科学学院南充637009

内质网(ER)是细胞中一个重要的细胞器,主要功能是脂质的合成、储存以及蛋白质的折叠、加工等。因此,严格调控和维持内质网稳态是至关重要的。在缺氧、Ca^(2+)稳态发生紊乱或者在机体需求和蛋白质折叠装置能力不平衡等情况下都会引起内... 详细信息

内质网(ER)是细胞中一个重要的细胞器,主要功能是脂质的合成、储存以及蛋白质的折叠、加工等。因此,严格调控和维持内质网稳态是至关重要的。在缺氧、Ca^(2+)稳态发生紊乱或者在机体需求和蛋白质折叠装置能力不平衡等情况下都会引起内质网应激(ERS),此时内质网会启动了细胞的一个适应性反应,这种反应被称之为未折叠蛋白反应(UPR)。结果,定位于内质网的分子伴侣被诱导,蛋白质的合成会减缓,与此同时蛋白质的降解系统也会启动。如果内质网应激不能被缓解,细胞凋亡将随之发生。本综述分析了由内质网应激所引起的未折叠蛋白反应信号通道,以及caspase-12在内质网凋亡途径中的核心作用。这为细胞凋亡的研究提供了一个新的角度,对肿瘤等疾病的治疗提供了一定的理论依据。

关键词：未折叠蛋白反应内质网应激 caspase-12 细胞凋亡

甜菜碱对酒精性肝损伤大鼠凋亡基因caspase-12表达的影响

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世界华人消化杂志 2005年第20期13卷 2437-2440页

作者：张频龚作炯武汉大学人民医院感染科湖北省武汉市430060

目的:研究甜菜碱对凋亡基因caspase-12表达的影响,探讨其抗酒精性肝损伤(ALD)大鼠肝细胞凋亡的机制.方法:采用酒精加鱼油灌胃配合高脂饮食建立酒精性肝损伤模型,应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫组化法检测大鼠肝组织凋亡... 详细信息

目的:研究甜菜碱对凋亡基因caspase-12表达的影响,探讨其抗酒精性肝损伤(ALD)大鼠肝细胞凋亡的机制.方法:采用酒精加鱼油灌胃配合高脂饮食建立酒精性肝损伤模型,应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫组化法检测大鼠肝组织凋亡基因caspase-12mRNA和蛋白水平.结果:与正常组比较,模型组大鼠肝组织caspase-12表达明显增强(mRNA:1.00vs0.18,P12vs1.00,P1215±0.0130,0.1850±0.0085vs0.2969±0.0451,P12,P1215±0.0130vs0.1850±0.0085,Pcaspase-12mRNA和蛋白的表达,可能是其减少凋亡的机制之一.

关键词：酒精性肝损伤甜菜碱 caspase-12 凋亡基因大鼠半定量逆转录聚合酶链反应免疫组化法检测蛋白水平肝损伤模型 mRNA

抗小鼠 caspase—12小干扰 RNA 对肝细胞凋亡的抑制作用

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中华肝脏病杂志 2005年第12期13卷 923-926页

作者：刘海防谢青姜山李光明周霞秋史毅俞红金由辛上海第二医科大学附属瑞金医院感染科 200025 上海第二医科大学附属新华医院消化科中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室

目的观察抗小鼠 caspase-12小干扰 RNA(siRNA)对小鼠原代肝细胞凋亡的抑制作用。方法原位二步灌流法分离并培养 Balb/c 小鼠原代肝细胞，化学合成制备三种抗 caspase-12不同位点(130， 214，521)的 siRNA，脂质体包裹转染小鼠原代肝... 详细信息

目的观察抗小鼠 caspase-12小干扰 RNA(siRNA)对小鼠原代肝细胞凋亡的抑制作用。方法原位二步灌流法分离并培养 Balb/c 小鼠原代肝细胞，化学合成制备三种抗 caspase-12不同位点(130， 214，521)的 siRNA，脂质体包裹转染小鼠原代肝细胞。毒胡萝卜素4μmol/L 诱导肝细胞凋亡。逆转录聚合酶链反应、western blot 检测抑制效果；四甲基偶氮唑盐法检测对细胞凋亡的影响。结果在浓度为 100 nmol/L 时，siRNA(130)对小鼠原代肝细胞 caspase-12 mRNA 的抑制率为0，siRNA(214)为52．08%， siRNA(521)为30．73%(t=4．30，P＜0．05)；在浓度为200 nmol/L 时，三种 siRNA 的抑制率分别为88．07%、 86．22%，89．41%。200 nmol/L 的 siRNA(214)对凋亡细胞 procaspase-12的抑制率为51．43%(t=4．30， P＜0．01)；MTT 比色实验发现，凋亡细胞活力增高48．76%(t=2．23，P＜0．01)。结论抗 caspase-12 siRNA 对小鼠原代肝细胞凋亡有一定的抑制作用。

关键词：肝细胞小鼠细胞凋亡 caspase-12 小干扰RNA