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微生物学报 2023年第7期63卷 2595-2608页

作者：陈松彪尚珂张春杰丁轲程相朝洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南洛阳471003 河南科技大学动物科技学院功能微生物与畜禽健康实验室河南洛阳471003

先天免疫是宿主抵御外来病原体入侵的第一道防线,而模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)是介导先天免疫应答关键分子。PRRs通过识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)来激活宿主先天免... 详细信息

先天免疫是宿主抵御外来病原体入侵的第一道防线,而模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)是介导先天免疫应答关键分子。PRRs通过识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)来激活宿主先天免疫反应。二十一世纪先天免疫领域里程碑式发现-环磷酸鸟苷腺苷合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cgas),cgas在宿主先天免疫过程中发挥重要作用,通过识别外源DNA产生第二信使2’,3’-环化鸟苷酸腺苷酸(2’,3’-cyclic guanosine monophosphate adenosine monophosphate,2’,3’-cGAMP)来介导干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,sting)的活化,从而促进下游干扰素(IFN)和其他细胞因子分泌来发挥宿主的抗病毒反应。近年研究发现,cgas/sting通路在宿主抗细菌感染过程中发挥着重要作用,同时细菌也进化出不同机制来拮抗cgas/sting通路。本文主要对cgas/sting通路的生物学功能及其在细菌感染中的作用进行综述,为进一步研发新型抗菌药物提供理论参考。

关键词：先天免疫 cgas/sting 生物学功能细菌感染

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二甲双胍通过调控cgas/sting信号通路抑制神经炎症改善肝性脑病小鼠认知及记忆功能障碍

二甲双胍通过调控cGAS/STING信号通路抑制神经炎症改善肝性脑病小...

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作者：刘启慧中国医科大学

学位级别：硕士

目的:肝性脑病(Hepatic encephalopathy,HE)是指严重肝病引起的、以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调综合征,表现为脑代谢紊乱、运动和神经认知功能缺陷等,典型特征为扑翼样震颤。HE起病隐匿,早期不易被发现,主要表现为神经心理学... 详细信息

目的:肝性脑病(Hepatic encephalopathy,HE)是指严重肝病引起的、以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调综合征,表现为脑代谢紊乱、运动和神经认知功能缺陷等,典型特征为扑翼样震颤。HE起病隐匿,早期不易被发现,主要表现为神经心理学或心理测试异常,如:认知障碍、记忆力减退、性格及行为改变等。血氨升高是HE发病核心因素,本研究通过建立高氨血症(Hyperammonia,HY)小鼠模型,使用二甲双胍(Metformin,MET)进行预防性治疗,初步探讨了MET对HE认知和记忆障碍的影响及对神经炎症的调节机制,为有效防治HE提供新的思路,以期为HE预防和治疗做出贡献。方法:选用成年雄性ICR小鼠(6-8周龄),随机分为对照组(Control)、模型组(UR)、二甲双胍组(MET)、模型组+二甲双胍组(UR+MET),适应性喂养一周后进行药物干预实验。Control组小鼠持续10天给予生理盐水;UR组先给予生理盐水7天后,再连续3天给予尿素酶(Urease,UR)(33单位/kg),建立HY小鼠模型;MET组小鼠给予MET(300 mg/kg)7天后,后3天同时给予MET和生理盐水;UR+MET组小鼠,先预防性给予MET 7天后,再连续3天同时给予MET和UR。药物干预实验结束后,第二天进行行为学测试:Morris水迷宫实验评估各组小鼠的行为学表现。使用蛋白免疫印迹实验(Western blot,WB)检测小鼠大脑前额皮质中环磷酸鸟苷-腺苷合酶(cyclic GMP-AMP synthase,c GAS)、干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon gene,sting)的表达;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR,q PCR)检测小鼠大脑皮质中炎症因子如:干扰素刺激因子15(Interferon stimulates gene 15,ISG15)、蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)、干扰素调节因子7(Interferon regulator 7,Irf7)的表达及胞质中线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mt DNA)的释放;采用尼氏染色观察小鼠大脑前额皮质神经元数量及形态的变化。结果:首先我们对小鼠进行了行为学分析,检测小鼠神经行为参数。在Morris水迷宫定位航行实验中,第1天各组小鼠搜索平台所花费时间基本无差别(P>0.05);从第2天开始,与Control组相比,UR组小鼠搜索平台所花费时间显著增多(P0.05),UR+MET组较UR组潜伏期时间显著缩短(P0.05),UR组与UR+MET组相比,UR+MET组小鼠皮质神经元数量较多,尼氏小体着色较深,胞体饱满。接着为了检测线粒体的功能,我们对胞质内mt DNA含量进行了定量。与Control组相比,UR组小鼠大脑前额皮质胞浆中mt DNA水平升高(Psting蛋白表达量显著升高(Psting蛋白表达量明显下降(Psting信号通路是否完全激活,我们检测其下游炎症因子的表达。与Control组相比,UR组小鼠大脑前额皮质中炎症因子ISG15、PKR、Irf7表达显著上调(Psting信号通路,下调Irf7、ISG15、PKR炎症因子,减轻神经炎症,发挥对神经元的保护作用,改善HE小鼠学习及记忆功能障碍。为有效防治H

关键词：二甲双胍肝性脑病 cgas/sting 神经炎症

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STK38通过调节cgas稳定性参与肿瘤细胞天然免疫通路调控

STK38通过调节cGAS稳定性参与肿瘤细胞天然免疫通路调控

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作者：高磊河北大学

学位级别：硕士

细胞对外界刺激的准确感知以及对其自身压力的检测是其完成正常生理需求的关键要素。胞浆ds DNA感受器cgas可以通过识别胞浆中的ds DNA进而促进Ⅰ型干扰素的表达,以此抵抗外来病原体的入侵以及对自身DNA的稳定性进行检测。cgas/sting作... 详细信息

细胞对外界刺激的准确感知以及对其自身压力的检测是其完成正常生理需求的关键要素。胞浆ds DNA感受器cgas可以通过识别胞浆中的ds DNA进而促进Ⅰ型干扰素的表达,以此抵抗外来病原体的入侵以及对自身DNA的稳定性进行检测。cgas/sting作为细胞压力的感受器其活性通常会影响到机体的健康状态,因此其活性受到复杂的分子调控。目前对cgas活性调控的研究主要集中于利用空间位阻来影响其蛋白活性,如甲基化、乙酰化等,或者去多聚泛素化维持来cgas的稳定性。但遗憾的是目前仍没有明确的证据来揭示影响cgas稳定性的E3泛素连接酶。在cgas质谱结果解析过程中,我们发现STK38与cgas的互作在应激后明显增强。STK38是Hippo信号通路家族成员,参与对癌细胞扩散、侵袭的调控,同时该信号通路也是对外界生存环境的感知通路。有研究报道Hippo通路中有蛋白可以通过泛素化修饰参与调控天然免疫通路,如激活后的YAP可以促进TBK1本身的K63多聚泛素化修饰,YAP蛋白通过调控cgas的非经典信号转导调控细胞的衰老进程等。但是Hippo信号通路与cgas稳定性之间的关系仍是未知的。本课题首次证明了STK38可以作为cgas的E3泛素连接酶调控其蛋白稳定性,从而参与对天然免疫通路的调节。本研究得到如下结果:首先,STK38可以与cgas互作并且降低后者稳定性。在He La细胞中梯度转染STK38质粒,发现cgas的蛋白水平明显下降。有趣的是当低浓度转染STK38时cgas的蛋白水平下降显著。利用HEK-293T细胞模拟cgas的体外泛素化实验,发现STK38可以明显促进cgas的泛素化修饰。进一步对cgas的半衰期检测发现,He La细胞中STK38过表达会将cgas的半衰期从8 h提前到6 h。进一步对两蛋白互作分析,发现细胞受到外界刺激后互作明显增强,且STK38的敲低会提升细胞对外界刺激的敏感性。将THP-1中的STK38敲低后利用HSV-60与poly d A:d T刺激发现,IFN-β的表达水平显著上升,TBK-1显著激活。上述结果表明STK38可以通过降低cgas的蛋白稳定性来抑制细胞对外界刺激做出的响应。其次,STK38可以对cgas K411位点进行多聚泛素化修饰,且该修饰也部分依赖于Smurf1的调节。利用STK38催化结构域保守赖氨酸进行定点突变,发现K411位点突变后,cgas不会再被STK38进行多聚泛素化修饰。进一步为解答STK38对cgas的催化修饰为何不满足传统的剂量依赖性这一科学问题,我们引入通用E3泛素泛素连接酶Smurf1,发现其也可以与cgas相互作用。在机制上,cgas可以同时招募Smurf1与STK38,两者都会促进cgas的泛素化修饰,但当两者同时过表达后会发现cgas多聚泛素化修饰显著降低。在He La细胞中单独过表达Smurf1也会降低cgas的蛋白水平,而进一步过表达低浓度STK38后发现cgas蛋白水平也明显降低,但同样随着STK38浓度的提高,cgas的蛋白水平也在明显恢复。此外我们在THP-1细胞中梯度过表达Smurf1,后用DNA类似物刺激发现IFN-β的蛋白表达受到显著抑制。在此基础上梯度过表达STK38会发现,随着高剂量STK38的加入IFN-β的蛋白表达水平显著恢复。上述实验证明了Smurf1可以参与cgas的活性调控,但Smurf1的活性受到了STK38浓度的调控。综上所述,我们的研究揭示了STK38可以作为cgas的E3泛素连接酶参与细胞天然免疫通路的调节。STK38可以促进cgas K411位点发生多聚泛素化修饰从而抑制后者稳定性,降低细胞对外界刺激的响应能力。机制上STK38会随着结合量的增加开始降解Smurf1从而保证细胞在应激后cgas仍维持在一定的生理水平。cgas激活后稳定性调控机制希望为临床上免疫急病的治疗带来新的思路。

关键词： cgas/sting Hippo信号通路 Smurf1 多聚泛素化修饰蛋白酶体降解

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新型锰佐剂联合肿瘤抗原抗肿瘤效果评价

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中国生物制品学杂志 2023年第3期36卷 288-294,305页

作者：杨立群梁朝远韩卢石思伟盛望北京工业大学环境与生命学部北京100124

目的探讨新型环状鸟嘌呤核苷酸-腺嘌呤核苷酸合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,c GAS)/干扰素基因刺激(stimulator of interferon genes,sting)通路激动剂MnCl_(2)联合肿瘤细胞裂解物(Lysate)和小鼠结肠癌MC38细胞系新抗原10K-Adpgk的抗肿瘤效果。方法从小鼠骨髓提取骨髓来源树突细胞(bone marrow-derived dendritic cell,BMDC),分为3组:PBS、1μmol/L MnCl_(2)和10μmol/L MnCl_(2)组,流式细胞术分析BMDC成熟情况,ELISA法检测细胞培养上清中IL-6浓度,q PCR法检测BMDC中相关IL-6、IFN-α、IFNβ、CXCL9基因转录水平。采用MC38细胞系建立小鼠肿瘤模型,当肿瘤体积达100 mm3时,随机分为PBS、Lysate、MnCl_(2)、10K-Adpgk、Lysate+MnCl_(2)组以及Lysate+10K-Adpgk+MnCl_(2)联合治疗组,均经尾部皮下给药,共给药3次,每次间隔1周,期间每2 d测量肿瘤体积,最后1次给药后1周,眼眶取血,分离血清,ELISA法检测IFNγ和TNF-α浓度;分离小鼠肿瘤及脾脏,流式细胞术检测外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中T细胞、肿瘤浸润性T细胞及脾脏中T细胞与记忆性T细胞比例,ELISPOT试验检测脾脏中抗原特异性T细胞比例。结果 10μmol/L MnCl_(2)可刺激BMDC成熟,激活后续免疫过程。联合治疗组小鼠肿瘤体积远小于PBS组,血清中IFNγ和TNF-α含量高于其他组,肿瘤浸润性T细胞、PBMC中T细胞以及脾脏中T细胞与记忆性T细胞比例与PBS组相比,也明显升高。联合治疗可引起强烈的抗原特异性T细胞免疫反应。结论新型佐剂MnCl_(2)的加入显著增强了肿瘤细胞裂解物和新抗原的治疗效果,为开发基于MnCl_(2)以及肿瘤抗原联合治疗肿瘤的方法提供了实验依据。

关键词：肿瘤细胞裂解物新抗原锰佐剂结肠癌 cgas/sting

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MITOL/sting信号通路在Irisin抵抗糖尿病心肌损伤中的作用

MITOL/STING信号通路在Irisin抵抗糖尿病心肌损伤中的作用

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作者：熊祥陕西中医药大学

学位级别：硕士

背景糖尿病是世界面临的最大流行病之一,其特征是慢性的高血糖和一系列伴随并发症。而糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是以心脏病理性肥厚、收缩和舒张功能障碍为特征的,但独立于其他一些常见心脏疾病的一种特殊心脏疾病。... 详细信息

背景糖尿病是世界面临的最大流行病之一,其特征是慢性的高血糖和一系列伴随并发症。而糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是以心脏病理性肥厚、收缩和舒张功能障碍为特征的,但独立于其他一些常见心脏疾病的一种特殊心脏疾病。随着糖尿病心肌病的进展,心衰的风险也在不断增加。因此,探讨糖尿病心肌病的潜在发病机制显得尤为重要。cgas/sting信号通路介导的焦亡已被证实与糖尿病心肌病的发生发展密切相关,但是否参与鸢尾素(Irisin)抵抗糖尿病心肌病损伤还需要进一步探究。既往研究证实,Irisin具有抗氧化,抗凋亡,抗炎症等作用,特别是在心肌细胞中发挥着重要作用。此外,Irisin可以通过上调MITOL线粒体稳态起到一个心肌保护作用。因此,Irisin是否可以通过调节线粒体结构和功能从而抵抗糖尿病心肌病损伤,在很大程度上仍然是不清楚的。目的探讨MITOL/sting信号通路在Irisin抵抗糖尿病心肌损伤中的作用,并为糖尿病心肌病的临床治疗提供新的潜在靶点。方法1.分别构建糖尿病小鼠模型和高糖高脂诱导的H9c2细胞模型:糖尿病小鼠模型分组如下:Con、Irisin、DCM、DCM+Irisin;高糖高脂诱导的H9c2细胞模型分组如下:PBS、Irisin、HG/HF、HG/HF+Irisin、HG/HF+Irisin+si MITOL。2.首先通过体内实验观察糖尿病心肌病小鼠与正常小鼠之间的差异,然后明确Irisin无论在体外实验还是体内实验是否都具有抵抗心肌损伤的作用,通过超声检测小鼠左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、左室舒张末期内径(LVIDd)以及左室收缩末期内径(LVIDs),通过HE和WGA染色观察细胞形态学变化,通过Masson染色观察病理胶原沉积情况,通过PI染色观察心肌细胞损伤情况,通过免疫荧光观察IL-1β的表达,通过Western blot实验检测cgas、sting、MITOL、NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β蛋白的表达情况。3.通过H9c2细胞模型探讨Irisin作用的潜在机制:在细胞层面给与Irisin和si MITOL,通过PI染色检测细胞死亡,通过JC-1染色检测线粒体膜电位,通过Western blot检测cgas、sting、MITOL、NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β蛋白的表达情况。结果1.在糖尿病小鼠上,相比于正常小鼠,我们可以看到小鼠的LVEF和LVFS明显降低,而LVIDd和LVIDs均明显升高,心肌组织有明显的病理胶原沉积,细胞形态增大,心肌细胞死亡增加。同时,cgas、sting和焦亡相关蛋白表达增加。在给与Irisin后,小鼠LVEF和LVFS均明显升高,而LVIDd和LVIDs均明显降低,并且细胞损伤减轻,cgas、sting和焦亡相关蛋白表达也显著降低。2.在H9c2细胞模型上,与对照相比,HG/HF诱导细胞死亡增加、线粒体膜电位降低以及cgas、sting和焦亡相关蛋白表达增加;在给与Irisin后,细胞死亡减少,膜电位恢复,cgas、sting和焦亡相关蛋白表达也降低了,但是MITOL表达升高。3.最后我们在HG/HF模型的基础之上,通过转染MITOL的小干扰RNA,可以观察到,相比于HG/HF+Irisin组,小干扰组的细胞死亡是显著增加,线粒体膜电位也显著降低,同时,cgas、sting和焦亡相关蛋白表达增加。总之,在加入si MITOL后,Irisin的保护作用被抵消了。结论Irisin通过上调MITOL,调节线粒体结构与功能,维持线粒体稳态,减少sting/GSDMD介导的细胞焦亡,从而进一步抵抗糖尿病心肌病造成的心肌损伤。

关键词：鸢尾素 MITOL 焦亡糖尿病心肌病 cgas/sting

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