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生物技术通报 2009年第3期25卷 57-60页

作者：宋晓宏沙伟东北林业大学哈尔滨150040 齐齐哈尔大学齐齐哈尔161006

cdna文库是指生物不同生长发育时期特定组织或器官所转录的全部mRNA经反转录形成的cdna与载体连接后形成的克隆的集合,在基因分离、克隆及功能研究中具有重要作用。就cdna文库构建及其在植物抗旱机制研究中的应用进行综述。

关键词： cdna文库抗旱 EST 应用

蒙古沙冬青干旱胁迫全长cdna文库构建及序列分析

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生物工程学报 2012年第1期28卷 86-95页

作者：林清芳王学峰李记园赵鸿彬王茅雁内蒙古农业大学生命科学学院内蒙古呼和浩特010018

为了规模化分离强抗逆植物蒙古沙冬青Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.)Cheng f.的抗旱基因并探讨其抗旱性分子机理,用SMART(Switching mechanism at 5′-end of RNA transcript)技术构建了其在干旱胁迫下的全长cdna文库。原始文库滴度为1.6×107PFU/mL,重组率为97.7%,插入片段长度多数接近和超过1 kb。对3 000个阳性克隆进行了5′端测序和序列分析,共获得1 450条Unigene序列。在Nt、Nr和Swissprot等数据库中进行Blast搜索,结果有919条(占63.4%)与已知或推测功能的基因具有同源性,其余531条(占36.6%)为功能未知的新基因。将Unigene进行Gene Ontology(GO)功能分类,其中与生理过程、细胞过程、结合、催化活性和细胞组分相关的基因所占比例较高,其次是与细胞器、蛋白复合体、运输和结构分子活性相关的基因,与刺激应答、基因表达调节、生理生化调节和信号转导相关的基因也占相当比例。许多有功能注释的Unigene属于抗逆相关基因,用半定量RT-PCR方法分析其中6个基因的表达变化,证明其均参与对干旱胁迫的应答反应。为进一步开展表达谱分析和克隆、鉴定抗旱基因奠定了基础。

关键词：沙冬青干旱 cdna文库序列分析

人食管癌cdna酵母杂交文库的构建与鉴定及其应用

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生物化学与生物物理进展 2003年第2期30卷 295-300页

作者：许丽艳李恩民牛永东蔡唯佳韩溟吴炳礼张灿沈忠英曾毅汕头大学医学院肿瘤病理研究室汕头515031 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室汕头515031 中国预防医学科学院病毒学研究所北京100052

以往在研究由促癌物 12 o 十四烷酰佛波醇 13 乙酯 (12 o tetradecanoylphorbol 13 acetate,TPA)诱导的人永生化食管上皮细胞恶性变中基因的差异表达情况时 ,曾获得中性粒细胞明胶酶相关lipocalin (neutrophilgelatinase associatedli... 详细信息

以往在研究由促癌物 12 o 十四烷酰佛波醇 13 乙酯 (12 o tetradecanoylphorbol 13 acetate,TPA)诱导的人永生化食管上皮细胞恶性变中基因的差异表达情况时 ,曾获得中性粒细胞明胶酶相关lipocalin (neutrophilgelatinase associatedlipocalin ,NGAL)等新的食管癌癌变相关基因 .为深入研究这些癌变相关基因在食管癌中以蛋白质蛋白质或蛋白质 DNA相互作用为基础的功能网络调控关系 ,建立了一个食管癌cdna酵母杂交文库 .采用Trizol试剂从一种新的人食管癌细胞 (SHEEC ,由人永生化食管上皮细胞转化而来 )中提取细胞总RNA ,采用OligotexmRNAKit从细胞总RNA中制备PolyA+ mRNA ,采用SuperScriptTM ChoiceSystemForcdnaSynthesisKit合成cdna ,以PolyA+ mRNA为探针 ,化学发光法监测cdna合成的质量 ,以 pGADT7为载体构建了SHEEC细胞的cdna酵母杂交文库 .文库的滴度为 1 19× 10 9cfu/ml,重组片段大小主要集中在 0 5～6 0kb ,重组率为 5 0 % .在此基础上 ,应用酵母单杂交技术手段对该文库中的NF κB元件结合因子进行了筛选 ,在SD/ his/ leu/[+15mmol/L 3 AT ]缺陷培养基平板上共获得了约 36 0个单克隆 .按照平板上酵母单克隆直径的大小 ,选择直径大于 2mm者 91个 ,提取质粒进行酶切鉴定和一对一酵母单杂交验?

关键词：人食管癌 cdna文库构建鉴定应用酵母杂交

K562细胞消减cdna文库的构建及初步鉴定

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癌症 2005年第5期24卷 631-633页

作者：宋艳斌马文丽冯春琼石嵘毛向明张宝郑文岭南方医科大学分子生物学研究所广东广州510515 广州军区流花桥医院肿瘤分子生物学研究所广东广州510010

背景与目的:消减杂交技术是一种寻找和克隆差异基因的方法。本研究目的是通过快速、高质量构建消减cdna文库,筛选K562细胞中差异表达基因。方法:以用限制性显示(restriction display,RD)技术制备的K562细胞cdna片段作为消减对象,以正常... 详细信息

背景与目的:消减杂交技术是一种寻找和克隆差异基因的方法。本研究目的是通过快速、高质量构建消减cdna文库,筛选K562细胞中差异表达基因。方法:以用限制性显示(restriction display,RD)技术制备的K562细胞cdna片段作为消减对象,以正常人淋巴细胞的Sau3AⅠ酶解cdna片段对其进行消减。经过消减后的RD片段被分组扩增出来,并克隆于T载体中,挑选阳性克隆进行测序并进行初步分析。结果:构建的K562细胞消减cdna文库,包含360个阳性克隆,插入片断大小范围在200～800bp之间,选取50个克隆进行测序分析,结果为来源于42个已知基因。结论:利用自行建立的消减杂交法,成功构建了特异性K562细胞消减cdna文库,文库质量可靠,可用于进一步筛选及克隆K562细胞中差异表达基因。

关键词： K562细胞消减杂交限制性显示 cdna文库

条纹斑竹鲨鱼再生肝组织cdna质粒文库的构建和鉴定

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高技术通讯 2005年第5期15卷 82-86页

作者：赵艳景胡亚楠刘睿王颖余江河叶波平王旻吴梧桐中国药科大学生命科学与技术学院南京210009

建立了鲨鱼肝脏的部分切除模型,获得了再生24h的鲨鱼肝组织,分离了再生肝组织的总RNA,纯化了mRNA,利用含BamHI酶切位点的Oligo(dT)16为引物合成cdna第一链,通过末端转移酶在cdna第一链3'末端加入Oligo(dC)尾,进而以Oligo(dT)16和含Hind... 详细信息

建立了鲨鱼肝脏的部分切除模型,获得了再生24h的鲨鱼肝组织,分离了再生肝组织的总RNA,纯化了mRNA,利用含BamHI酶切位点的Oligo(dT)16为引物合成cdna第一链,通过末端转移酶在cdna第一链3'末端加入Oligo(dC)尾,进而以Oligo(dT)16和含HindIII酶切位点的Oligo(dG)10为引物,通过LD-PCR (long- distance-PCR)方法合成双链cdna,将双链cdna经BamHI和HindIII双酶切,通过T4DNA连接酶连接到经相同酶切的pUC19载体后构建成cdna文库.对文库质量的分析结果表明,通过本方法构建的鲨鱼再生肝组织cdna文库容量至少为4.92×105个/μg dscdna,重组率达96.7%.对随机提取30个克隆的质粒进行分析,获得了其中25个插入片段的序列,未见重复序列,经与GenBank和dbEST数据库比对分析发现新基因在其中占较大的比例(76%).鲨鱼再生肝组织cdna文库的成功构建为进一步通过差异显示技术筛选、克隆肝再生过程中差异表达的相关功能基因奠定了一个良好的基础.

关键词：肝组织鲨鱼构建质粒文库 cdna第一链 T4DNA连接酶 cdna文库 GenBank 鉴定斑竹条纹 EST数据库差异显示技术酶切位点末端转移酶总RNA mRNA 分析结果重复序列比对分析功能基因差异表达再生过程双酶切库容量

铁皮石斛均一化全长cdna文库的构建与序列分析

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中国中药杂志 2013年第4期38卷 504-510页

作者：蒋敏王江文国松徐绍忠查应洪容天聚钱雄云南农业大学云南省优势中药材规范化种植工程研究中心云南昆明650201 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所上海200032 云南红河群鑫石斛种植有限公司云南红河661200

目的:为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因。方法:以SMART(switching mechanism at5'end of RNA transcript)方式合成全长cdna,结合DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术,构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cdna文... 详细信息

目的:为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因。方法:以SMART(switching mechanism at5'end of RNA transcript)方式合成全长cdna,结合DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术,构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cdna文库。结果:该文库重组率为93.9%,文库滴度1.3×106cfu.mL-1,插入片段平均大小1.5 kb左右。随机挑取163个阳性克隆进行单侧测序,通过生物信息学分析,获得150个单一序列,其中147个序列与相应的同源蛋白匹配,GO(geneontology)分类表明这些序列参与各种生化途径。8个序列包含了完整编码框,可判断为全长基因。结论:成功构建了铁皮石斛茎组织均一化全长cdna文库,为满足铁皮石斛代谢途径等功能基因筛选和基因信息研究奠定了基础。

关键词：铁皮石斛均一化 cdna文库序列分析

大鼠感染血清免疫筛选弓形虫速殖子cdna文库

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2003年第2期21卷 87-89页

作者：蒋立平吴翔蔡力汀王丹静舒衡平中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室长沙410078

目的为弓形虫病疫苗的研制提供新的抗原分子.方法用弓形虫RH株速殖子感染大鼠,分离其血清作为探针筛选弓形虫cdna文库,对阳性克隆的插入片段分别进行PCR扩增及DNA序列测定.结果从cdna文库4×105个噬菌斑中筛选出13个阳性克隆,其插入片... 详细信息

目的为弓形虫病疫苗的研制提供新的抗原分子.方法用弓形虫RH株速殖子感染大鼠,分离其血清作为探针筛选弓形虫cdna文库,对阳性克隆的插入片段分别进行PCR扩增及DNA序列测定.结果从cdna文库4×105个噬菌斑中筛选出13个阳性克隆,其插入片段大小分别为0.45～2.4kb.对L1、L2、L4和L5四个克隆进行测序,将所得序列查询基因库,结果,克隆L2与弓形虫P24主要抗原基因序列相同,L4与蔗糖丙酮酸磷酸激酶具有同源性,L1无任何相匹配的序列,为未曾报告过的新基因(GenBank登录号为AY180109),命名为T.g-R1.T.g-R1编码134个氨基酸的非跨膜蛋白.PROSCAN分析显示T.g-R1含有2个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个肉豆酸酰化位点,1个微体细胞C端靶信号.L5为一小片段,无完整编码读框.结论阳性克隆的筛选和鉴定为抗弓形虫病疫苗的研制提供又一途径.

关键词：弓形虫病疫苗 cdna文库免疫筛选 PCR扩增 DNA序列测定

森林革蜱半饱血雄蜱抑制消减杂交cdna文库的构建及差异基因的分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2014年第4期32卷 274-279页

作者：刘琪王伟琳孟庆峰徐展崔洁刘新欣王伟利吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 吉林出入境检验检疫局长春130062

目的构建森林革蜱（Dermacentor silvarum）半饱血雄蜱抑制消减杂交cdna文库,分析差异基因。方法以森林革蜱半饱血雄蜱为实验组（tester）,未吸血雄蜱为对照组（driver）,分别提取总RNA,SMARTER PCR合成双链cdna,RsaⅠ酶切后连接接头并... 详细信息

目的构建森林革蜱（Dermacentor silvarum）半饱血雄蜱抑制消减杂交cdna文库,分析差异基因。方法以森林革蜱半饱血雄蜱为实验组（tester）,未吸血雄蜱为对照组（driver）,分别提取总RNA,SMARTER PCR合成双链cdna,RsaⅠ酶切后连接接头并进行抑制消减杂交。巢式PCR扩增杂交产物,经柱纯化后连接至PMD-18T中,转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,进行蓝白斑筛选,并计算文库滴度和重组率。随机挑选阳性克隆,反向Northern杂交（Northern blotting）和RT-PCR法检测抑制消减杂交cdna文库的消减效率。随机选取差异基因阳性克隆送测序,利用Blastn和Blastx对测序结果进行核酸种类同源性分析和蛋白种类同源性的比对和功能预测。结果电泳结果显示,森林革蜱半饱血雄蜱和未吸血雄蜱的ds cdna均呈弥散拖影,大小在500bp以上,经RsaⅠ酶切后,大小在100～1000 bp;接头连接效率大于25%。巢式PCR结果显示,消减的ds cdna呈聚集条带,大小在250～500 bp。构建的森林革蜱半饱血雄蜱抑制消减杂交cdna文库的滴度为700 000 pfu/ml,重组率为88.5%（239/270）。反向Northern blotting检测结果显示,当以森林革蜱半饱血雄蜱单链cdna为探针时,消减文库信号较强;以未吸血雄蜱单链cdna为探针时,消减文库信号较弱。RT-PCR结果显示,随机选取的8个阳性克隆中,有5个在半饱血状态下表达上扬,抑制消减杂交cdna文库消减效果较好。115个阳性克隆测序得到87个差异表达序列标签（ESTs）,大小为200～800 bp。Blastn分析结果显示,87个序列中,与其他蜱基因有同源性的53个,同源性为70%～98%,与库蚊、甲虫和果蝇等其他昆虫基因有同源性的34个,同源性为32%～65%。Blastx预测结果显示,序列中片段表达的蛋白包括参与吸血和血液消化的不同酶类,主要功能为能量代谢、信号传导和转录调节等。结论建立了森林革蜱半饱血雄蜱抑制消减杂交cdna文库,差异基因的功能预测与蜱的吸血和血液消化等有关。

关键词：森林革蜱抑制消减杂交 cdna文库差异基因

高产紫杉醇菌株的诱变选育及其差异表达基因消减cdna文库的构建

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微生物学报 2011年第7期51卷 923-933页

作者：赵凯孙立新王旋李秀凉王歆周东坡黑龙江大学生命科学学院微生物黑龙江省高校重点实验室农业微生物技术教育部工程研究中心哈尔滨150080 黑龙江省农业科学院生物技术研究所哈尔滨150086 黑龙江大学校医院哈尔滨150080

【目的】选育高产紫杉醇菌株,并构建选育到的高产紫杉醇菌株与出发菌株HD1-3差异表达的cdna消减文库。【方法】分别采用硫酸二乙酯和紫外线与硫酸二乙酯复合诱变处理菌株HD1-3孢子;以选育到的高产紫杉醇菌株为tester,菌株HD1-3为driver... 详细信息

【目的】选育高产紫杉醇菌株,并构建选育到的高产紫杉醇菌株与出发菌株HD1-3差异表达的cdna消减文库。【方法】分别采用硫酸二乙酯和紫外线与硫酸二乙酯复合诱变处理菌株HD1-3孢子;以选育到的高产紫杉醇菌株为tester,菌株HD1-3为driver,应用抑制性消减杂交技术构建选育到的高产紫杉醇菌株与菌株HD1-3差异表达的cdna消减文库。【结果】试验确定的Nodulisporium sylviforme紫杉醇产生菌HD1-3孢子复合诱变的适宜条件为:将106 cfu/mL孢子悬液经过8%硫酸二乙酯处理15 min后,在电磁搅拌下,用紫外灯(30 w,距离30 cm)照射处理45 s,获得了1株遗传性状稳定、高产紫杉醇的突变株——UD14-11,其紫杉醇产量从出发菌株HD1-3的232.73±4.61μg/L提高至312.81±7.51μg/L;构建的文库滴度为1.2×107 cfu/mL,阳性克隆率75.3%,片段大小主要集中在300 bp-1.0 kb。【结论】选育到了1株遗传性状稳定、高产紫杉醇突变株;成功地构建了高产紫杉醇菌株UD14-11与菌株HD1-3差异表达的cdna消减文库,为寻找、分离微生物生物合成紫杉醇相关基因和利用基因工程或代谢工程手段定向设计改造菌株奠定基础。

关键词：紫杉醇内生真菌诱变育种抑制性消减杂交 cdna文库

猫肠上皮细胞的原代培养及cdna文库的构建

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中国血吸虫病防治杂志 2017年第4期29卷 464-467,474页

作者：刘烨赵桂华尹昆王洪法肖婷刘功振仲维霞崔勇济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院山东省寄生虫病防治研究所济宁272033 山东省济宁市第一人民医院医学检验科

目的建立猫肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)培养体系,构建其酵母双杂交cdna文库,为筛选弓形虫毒性因子在终末宿主的互作蛋白奠定基础。方法分别采用组织块法以及低浓度胶原蛋白酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法进行猫IECs的... 详细信息

目的建立猫肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)培养体系,构建其酵母双杂交cdna文库,为筛选弓形虫毒性因子在终末宿主的互作蛋白奠定基础。方法分别采用组织块法以及低浓度胶原蛋白酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法进行猫IECs的原代培养,通过形态学观察及细胞免疫组织化学方法鉴定后提取mRNA,运用SMART技术合成cdna第一链,以LD-PCR扩增获得双链cdna(ds cdna),通过同源重组方法在酵母菌株Y187中构建猫IECs的cdna文库,计算文库的容量,以酵母菌液PCR检测插入片段的大小分布。结果两种培养方法效果表明酶联合消化法更为有效。本研究建立了连续培养猫IECs体系,培养出高纯度的猫IECs,用其构建的cdna文库容量为1.1×10~6,滴度为2.8×10~9cfu/ml,插入片段大小在0.5~2.0 kb之间。结论培养的原代猫IECs构建的cdna文库符合酵母双杂交筛选互作因子标准,这为筛选弓形虫终末宿主的毒性因子互作蛋白奠定了基础。

关键词：弓形虫肠上皮细胞猫原代培养酵母双杂交 cdna文库