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受瓜类褪绿黄化病毒侵染的甜瓜茎叶酵母双杂交cdna文库构建

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植物保护学报 2014年第4期41卷 509-510页

作者：施艳王英志孙虎王振跃河南农业大学植物保护学院郑州450002 河南省农业科学院植物保护研究所郑州450002

瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)属于长线形病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus,基因组由2条正义单链RNA构成,RNA1基因组约8.6 kb,RNA2基因组约8 kb,作为2010年报道的新病毒[1],至今已在中国[2]、日本、苏丹[3]和黎巴嫩[4]等地发生。CCYV在黄瓜Cucumis sativus L.和甜瓜Cucumis melo L.叶片上引起典型的褪绿黄化症状,严重影响瓜类的产量和品质。目前关于CCYV的研究主要是病毒基因组序列以及病毒检测的报道。

关键词：甜瓜茎酵母双杂交毛形病毒属 cdna文库构建褪绿 Cucumis 长线形病毒科病毒蛋白 melo 病毒侵染

cdna文库构建策略及其在盐生植物中的应用

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新疆农业科学 2008年第6期45卷 1017-1023页

作者：姚世响兰海燕新疆大学生命科学与技术学院/新疆生物资源基因工程重点实验室乌鲁木齐830046

构建各种cdna文库是目前发现新基因的基本策略,同时也是功能基因组学研究的一个主要方法。cdna文库主要包括cdna全长文库、cdna差减文库和cdna均一化文库等类型,各种文库的原理、构建方法和适用范围都有很大的不同。近年来,通过构建各种... 详细信息

构建各种cdna文库是目前发现新基因的基本策略,同时也是功能基因组学研究的一个主要方法。cdna文库主要包括cdna全长文库、cdna差减文库和cdna均一化文库等类型,各种文库的原理、构建方法和适用范围都有很大的不同。近年来,通过构建各种cdna文库、获得大规模高质量EST数据库,并在此基础上分离克隆抗逆相关基因已经成为研究植物耐盐机理的重要途径。旨在对cdna文库的主要类型及其构建策略,以及cdna文库在盐生植物新基因筛选中的应用进行综合论述,并对植物耐盐机制的研究提出了展望。

关键词： cdna文库构建盐生植物耐盐新基因

具有不同抗螨特性的东方蜜蜂cdna文库构建和CSP3基因CDs序列分析

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江苏农业科学 2013年第2期41卷 21-24页

作者：陈杨余林生申洁琼吉挺刘振国沈杰安徽农业大学安徽合肥230036 扬州大学江苏扬州225000

本研究旨在分析不同抗螨特性的东方蜜蜂的CSP3基因的CDs序列的差异,以寻找与抗螨相关的基因。根据NCBI数据库中西方蜜蜂(Apis mellifera L.)CSP3(Chemosensory protein 3)基因的mRNA序列设计引物,以cdna文库为模板克隆并测序获得CSP3基... 详细信息

本研究旨在分析不同抗螨特性的东方蜜蜂的CSP3基因的CDs序列的差异,以寻找与抗螨相关的基因。根据NCBI数据库中西方蜜蜂(Apis mellifera L.)CSP3(Chemosensory protein 3)基因的mRNA序列设计引物,以cdna文库为模板克隆并测序获得CSP3基因的CDs序列。结果显示:东方蜜蜂感螨组和对照组在153位点存在碱基变异(A→G),该位点的变异为无义突变;东西方蜜蜂在54、164、279、284 bp位点存在着G→A(V→I)、A→T(E→D)、T→A(S→T)、G→C(E→D)的差异,西方蜜蜂在112 bp位点的gat碱基缺失导致编码氨基酸缺少1个丝氨酸,体现了两者在物种上的差别。CSP3基因CDs序列的差异与蜜蜂抗螨性能的相关性有待于进一步研究。

关键词：东方蜜蜂狄斯瓦螨 cdna文库构建 CSP3基因序列分析

不同木质素诱导下糙皮侧耳cdna文库构建分析

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不同木质素诱导下糙皮侧耳cDNA文库构建分析

作者：张霞东北林业大学

学位级别：硕士

黑木耳(Auricularia auricular)为木生菌,能很好地利用木质栽培基质,如木屑等。随着天然林保护工程的实施,栽培原料的紧缺极大地限制了黑木耳产业的发展。利用分子育种技术提高黑木耳对秸秆等草质栽培基质的利用效率是黑木耳栽培产业稳... 详细信息

黑木耳(Auricularia auricular)为木生菌,能很好地利用木质栽培基质,如木屑等。随着天然林保护工程的实施,栽培原料的紧缺极大地限制了黑木耳产业的发展。利用分子育种技术提高黑木耳对秸秆等草质栽培基质的利用效率是黑木耳栽培产业稳定、持续发展的有效途径之一。糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)既可利用木质栽培基质,又可以很好地利用草质栽培基质,对木屑和秸秆的生物转化率均很高。利用转基因技术将糙皮侧耳的草类木质素降解基因定向转育到黑木耳中,使黑木耳能够高效利用草类栽培基质,理论上是可行的。本研究针对糙皮侧耳已知的草类木质素降解相关基因知之甚少这一问题,以糙皮侧耳为研究对象,利用SSH技术,分别构建了糙皮侧耳降解稻草秸秆木质素和蒙古栎木质素cdna文库,通过对两个文库的分析,获得各自的高效表达基因。该研究成果将为研究糙皮侧耳对不同种类木质素降解的分子机理奠定基础。主要研究结果如下： 1、采用Trizol法、STE法和改进的STE法3种RNA提取方法对糙皮侧耳菌丝体进行总RNA提取。结果表明：改进的STE法提取的RNA较常规的Trizol法和单纯的STE法提取的RNA质量好,条带清晰完整,胶孔无残留蛋白等杂质。纯化后mRNA为总RNA浓度的1/50-1/100,driver和tester的OD260/OD280值分别为1.90(D),2.10(T-1)和2.08(T-2)。 2、分别构建了糙皮侧耳(P. ostreatus)降解草本木质素和木本木质素cdna文库SSH1和SSH2,文库阳性克隆比分别为75%和95%,符合一般文库要求。分别随机挑取200个和280个阳性克隆进行测序及后续去除载体等工作,SSH1和SSH2文库片段长度分别主要集中在0.25-0.5kb和0.25-0.65kb范围内。高同源性基因主要来源于双色蜡蘑(Laccaria bicolor)、灰盖鬼伞(Coprinus cinerea)、糙皮侧耳(P. ostreatus)、裂褶菌(Schizophyllum commune)和凤尾菇(Pleurotus sajurcaju)等。 3、SSH1文库中冗余表达的基因有泛激素、钙调蛋白、adp-糖基化因子和精氨酸酶,冗余数分别为7、2、3、2,其中泛激素的冗余度尤为显著。与草本木质素降解相关的ESTs主要参与细胞抵抗与防御相关过程、蛋白质合成及降解和信号传导过程,包括谷胱甘肽合成酶(GSH2)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、热激蛋白(HSP)基因;泛激素-蛋白酶系统(UPS)中的泛激素、20S蛋白酶体及RBX基因;adp-糖基化因子、RhoG蛋白和钙调素等基因。 4、SSH2文库基因包括新陈代谢、细胞抵御、信号转导、转录因子、蛋白质合成修饰与降解及物质转运几类,其种类数分别为22、17、10、3、7、5。与木本木质素降解相关ESTs主要为漆酶基因(Laccase)、抗氧化基因(如GR、Prx和Trx)、duf895区域膜蛋白基因、Ca2+/CaMK基因、伴刀豆球蛋白阿霉素诱导蛋白c、锌指蛋白、磷酸酮醇酶、丙酮酸脱羧酶、热激蛋白、硫氧还蛋白、双特异件蛋白磷酸酶等,其中以伴刀豆球蛋白阿霉素诱导蛋白c和锌指蛋白的冗余度最为显著。 5、对文库SSH1及SSH2中的主要ESTs分别进行了较详细的分析讨论,包括GSH、GST、Rho、泛激素、RBX基因、钙调素等基因(SSH1文库)和Laccase、 Prx、GR、Trx、囊泡运输蛋白sec17、ADP/ATP转运蛋白基因等(SSH2文库)。参照KEGG数据库,文库SSH2的ESTs可能参与的代谢途径有33个,主要有次级代谢生物合成、莽草酸途径的生物碱合成、萜类和淄酮类生物碱的合成及类苯基丙烷生物合成等。综上,改进的STE法更适合糙皮侧耳菌丝体总RNA的提取。糙皮侧耳ESTs中与草本木质素降解相关的ESTs和与木本木质素降解相关的ESTs存在显著的差异,因此所参与的代谢途径可能也不同。

关键词：糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus) 木质素降解分子机理抑制消减杂交技术 cdna文库构建

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杉木茎段皮层cdna文库构建及EST分析

分子植物育种 2008年第4期6卷 683-688页

作者：洑香香杨立伟施季森王桂凤南京林业大学林木与基因工程实验室南京210037

在利用ZAP Express cdna试剂盒构建杉木茎段皮层cdna文库,随机测序共获得1119条有效序列。利用Sequencher 2.0 Demo软件对EST进行聚类分析与拼接,共获得354个非重复序列(UniGenes),其中包括129个重叠群(contigs)(占36.44%)和225个独立ES... 详细信息

在利用ZAP Express cdna试剂盒构建杉木茎段皮层cdna文库,随机测序共获得1119条有效序列。利用Sequencher 2.0 Demo软件对EST进行聚类分析与拼接,共获得354个非重复序列(UniGenes),其中包括129个重叠群(contigs)(占36.44%)和225个独立ESTs(singletons)(占63.56%)。BlastX比对发现仅有16.4%UniGenes和数据库中至少1条序列是高度相似、19.8%为中度相似、14.1%低度相似,而有近50%在数据库中无匹配序列。基因注释发现文库中表达量较高的特征基因有ARP(auxin-repressed protein)、金属硫因蛋白(metallothionein-like protein,MT)、bZIP转录因子。其中ARP(auxin-repressed protein)是值得关注的基因片段,它可能与杉木分枝及茎的伸长有关。

关键词：杉木 cdna文库构建 EST

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微小牛蜱唾液腺cdna文库的构建

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2008年第5期26卷 389-391页

作者：田占成刘光远谢俊仁龚真莉中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

从微小牛蜱唾液腺中提取RNA,纯化mRNA,合成双链cdna,定向克隆到λSCREEN载体的两臂之间。用噬菌体蛋白包装产物对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠埃希菌ER1647,构建成微小牛蜱唾液腺的cdna表达文库。经测定,文库... 详细信息

从微小牛蜱唾液腺中提取RNA,纯化mRNA,合成双链cdna,定向克隆到λSCREEN载体的两臂之间。用噬菌体蛋白包装产物对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠埃希菌ER1647,构建成微小牛蜱唾液腺的cdna表达文库。经测定,文库的库容量约为1.38×106PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109PFU/ml。用兔抗微小牛蜱唾液腺蛋白阳性血清,对文库进行初步免疫学筛选,获得一个细胞色素氧化酶第2亚基cdna序列。将该基因序列与GenBank中的序列进行同源性比对,发现与已知的其他物种细胞色素氧化酶第2亚基的氨基酸序列同源性为60%～77%。微小牛蜱唾液腺cdna表达文库构建成功。

关键词：微小牛蜱唾液腺 cdna文库构建

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春大豆花芽cdna文库的构建及质量分析

华南农业大学学报 2014年第1期35卷 73-78页

作者：王楠周莹姚丹尹俊琦曲静王丕武吉林农业大学农学院吉林长春130118 吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118

【目的】为了解大豆多荚、多粒相关基因的调控机制，构建了大豆花芽eDNA文库，根据要求初步鉴定了所构建文库的质量．【方法】以大豆吉农18突变体的幼嫩花芽为材料提取总RNA，采用SMART技术合成双链cdna．经蛋白酶K的消化及靳I酶切后，... 详细信息

【目的】为了解大豆多荚、多粒相关基因的调控机制，构建了大豆花芽eDNA文库，根据要求初步鉴定了所构建文库的质量．【方法】以大豆吉农18突变体的幼嫩花芽为材料提取总RNA，采用SMART技术合成双链cdna．经蛋白酶K的消化及靳I酶切后，将所得eDNA克隆到λTriplEx质粒载体中，成功构建了大豆花芽全长cdna文库．【结果和结论】将初始文库经扩增后保存，检测扩增文库滴度为2．13×10^8pfu／mL，重组率接近95．3％，菌落PCR鉴定插入片段主要分布在0．5～2．0kb．插入片段平均大小在1．0kb左右．表明本研究所构建的文库既满足了目的基因的分离筛选，又可保证全长eDNA文库的获得，该文库的构建为进一步开展相关基因的克隆及分子生物学研究奠定基础．

关键词：大豆花芽 cdna文库构建质量分析

微小隐孢子虫cdna文库的构建与免疫学筛选

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2013年第8期41卷 7-12页

作者：高依然张静韩福松陆慧君姜宁陈启军尹继刚吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病研究教育部重点实验室吉林长春130062

【目的】构建微小隐孢子虫cdna文库,以筛选出可替代天然抗原用于诊断的重组抗原。【方法】首先纯化微小隐孢子虫卵囊,用Trizol Reagent提取总RNA,构建全长cdna;分别用蛋白酶K与Sfi消化、酶切处理cdna,采用Column Spin H-1000分离柱分离c... 详细信息

【目的】构建微小隐孢子虫cdna文库,以筛选出可替代天然抗原用于诊断的重组抗原。【方法】首先纯化微小隐孢子虫卵囊,用Trizol Reagent提取总RNA,构建全长cdna;分别用蛋白酶K与Sfi消化、酶切处理cdna,采用Column Spin H-1000分离柱分离cdna,连接λTriplEx2载体,构建cdna文库。扩增cdna文库,用兔抗微小隐孢子虫血清作探针对cdna文库进行初筛和复筛,将复筛得到的阳性克隆连接PMD18-T载体,测序后进行序列比对。【结果】微小隐孢子虫cdna文库噬菌斑插入片段长度为1.5kb左右,库容大于107。经过筛选共获得了20个微小隐孢子虫阳性克隆,测序后从中选出了4个主要免疫识别抗原蛋白,分别为MUCIN蛋白、乳酸脱氢酶、微管相关蛋白和子孢子抗原蛋白。【结论】成功构建了微小隐孢子虫cdna文库,并筛选出了4个主要免疫识别抗原蛋白,为隐孢子虫的血清学诊断提供了重组抗原。

关键词：微小隐孢子虫 cdna文库构建免疫学筛选

低温诱导东乡野生稻幼苗期叶片cdna文库的构建和鉴定

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杂交水稻 2010年第2期25卷 59-62,77页

作者：李玲龙邢俊杰崔玲玲韩小霞阳志刚李丁谢灵灵曹孟良中南大学研究生院隆平分院湖南长沙410125 长沙杂交水稻基因工程技术研究中心湖南长沙410205 国家杂交水稻工程技术研究中心湖南长沙410125

从8℃低温诱导的东乡野生稻幼叶中提取总RNA,以总RNA为模板,利用SMART技术合成第1链,再经LD-PCR扩增合成第2链后,将获得的双链cdna与双元表达载体YPL3连接,重组质粒电转入大肠杆菌,成功构建了东乡野生稻cdna文库。经测定,原始文库滴度... 详细信息

从8℃低温诱导的东乡野生稻幼叶中提取总RNA,以总RNA为模板,利用SMART技术合成第1链,再经LD-PCR扩增合成第2链后,将获得的双链cdna与双元表达载体YPL3连接,重组质粒电转入大肠杆菌,成功构建了东乡野生稻cdna文库。经测定,原始文库滴度平均为4.4×107cfu/mL,平均插入片段约1kb,重组率为100%,符合cdna文库构建要求,为后续利用酵母功能互补技术筛选东乡野生稻有利基因奠定了基础。

关键词：东乡野生稻低温诱导 cdna文库构建 SMART技术