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西瓜果实发育过程中转录组的初析

中国瓜菜 2019年第8期32卷 182-183页

作者：丁双玉(编译) 许勇(编译) 郭绍贵(编译) 刘景安郑轶黄明云张海英宫国义何洪巨任毅钟思林费章君北京市农林科学院蔬菜研究中心美国康奈尔大学博伊斯汤普森植物研究所

目的与意义:目前关于西瓜果实在分子水平上发育和成熟的信息非常少,栽培西瓜是一种非呼吸越变型水果.到目前为止,只有一份报告描述了西瓜果实发育过程中一小部分基因的表达,对西瓜进行了大规模的转录组测序,以期对西瓜果实发育过程中的... 详细信息

目的与意义:目前关于西瓜果实在分子水平上发育和成熟的信息非常少,栽培西瓜是一种非呼吸越变型水果.到目前为止,只有一份报告描述了西瓜果实发育过程中一小部分基因的表达,对西瓜进行了大规模的转录组测序,以期对西瓜果实发育过程中的分子基础有更多了解.材料与方法:使用西瓜自交系‘97103’作为试验材料,在西瓜成熟过程中的白肉阶段、粉肉、红肉和过熟阶段分别测序cdna,进行cdna序列处理、组装、注释和比较基因组学分析,鉴定西瓜差异表达的基因,测定糖、可溶性固形物和类胡萝卜素的含量以及果肉硬度,qRT-PCR分析2个糖代谢基因.

关键词：果实发育过程转录组西瓜比较基因组 cdna序列可溶性固形物试验材料类胡萝卜素

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甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的序列分析

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农业生物技术学报 1995年第3期 44-48页

作者：崔星明周国英彭海垄祖埙于嘉林刘仪中国科学院上海生物化学研究所北京农业大学石河子农学院

用根据国外已报道的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）的ＲＮＡ２的序列合成的两个引物，通过对ＢＮＹＶＶ新疆分离物的ＲＮＡ逆转录获得了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白基因的ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增后用Ｔ４聚合酶补平两端，克隆到ｐＧＥＭ一７... 详细信息

用根据国外已报道的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）的ＲＮＡ２的序列合成的两个引物，通过对ＢＮＹＶＶ新疆分离物的ＲＮＡ逆转录获得了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白基因的ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增后用Ｔ４聚合酶补平两端，克隆到ｐＧＥＭ一７Ｚｆ（＋）质粒的Ｓｍａｌ位点，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经筛选得到正向插入的重组质粒ｐＧＥＢ３。用ＰＣＲ扩增和酶切均得到５９０ｂｐ的ＤＮＡ片段。用Ａｍ３７０Ａ型ＤＮＡ全自动序列仪测出该ｃＤＮＡ序列中的ＣＰ基因为５６７ｂｐ，与国外报道的ＢＮＹＶＶＣＰｃＤＮＡ长度一致，核苷酸同源率９６．６％，由此推导的氨基酸同源率为９８．９％。该基因与ＢＮＹＶＶ内蒙分离物核苷酸同源率为９９．８％，氨基酸同源率为９９．５％。

关键词：甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因 cdna序列

青霉菌灭活菌丝体诱导的烟草抑制消减杂交cdna表达文库的构建

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青霉菌灭活菌丝体诱导的烟草抑制消减杂交cDNA表达文库的构建

作者：陈林云南大学

学位级别：硕士

我国是烟草大国,烟草及其烟草制品在我国国民经济中具有重大支撑作用,烟草抗病机理的研究工作一直在持续进行中,因此,本研究通过构建青霉菌灭活菌丝体处理后的烟叶cdna抑制消减文库,旨在为系统全面的烟叶诱导性抗性的机理机制研究提供... 详细信息

我国是烟草大国,烟草及其烟草制品在我国国民经济中具有重大支撑作用,烟草抗病机理的研究工作一直在持续进行中,因此,本研究通过构建青霉菌灭活菌丝体处理后的烟叶cdna抑制消减文库,旨在为系统全面的烟叶诱导性抗性的机理机制研究提供良好平台和做好基因库储备。本文以0.4%青霉菌灭活菌丝体处理5-6叶期红花大金元烟叶作为tester组,以5-6叶期红花大金元烟叶清水处理组作为driver组,构建抑制消减cdna文库。通过实验,成功构建了正向消减文库包括356个克隆和反向消减文库包括310个克隆。克隆饱满清晰。经过统计计算,文库的滴度达到2.2×109cfu/ml,阳性克隆比例为86%。对饱满、清晰的77个阳性克隆进行DNA序列测定,序列平均大小为298bp,并将其在NCBI上应用Blastn和Blastx进行比对,最终比对出26个不同功能的蛋白质,另外还有7种蛋白质,未知功能的预测蛋白质;一个基因有同源序列,但是比对不出同源蛋白质;一个既没有同源序列也没有同源蛋白质。 77个阳性克隆中,共有26个不同功能的蛋白质,其中主要与转录、能量代谢、蛋白合成、细胞结构、信号传导、抗病防御、细胞保护相关。其中与转录相关的共两种2个克隆,能量代谢相关的共有四种11个克隆,与蛋白合成相关的共有两种2个克隆,与信号传导相关的共有两种2个克隆,与抗病防御相关的共有六种19个克隆,与细胞保护相关的共有六种7个克隆,其余30个阳性克隆基因功能未知。在已知功能的47个基因中,抗病防御的相关功能基因最多,占已知功能基因总数的41.3%,其次是能量代谢和细胞保护的基因,达到23.4%、14.9%,其余的有关细胞结构、蛋白合成、转录及信号传导的相应较少,分别占到8.5%、4.3%、4.3%和4.3%。本研究构建了青霉菌灭活菌丝体处理的烟叶抑制消减cdna文库,并对文库中的部分阳性克隆进行了测序及比对分析,本文库的成功构建将对下面的烟叶抗性相关基因研究起到积极作用。

关键词：青霉菌灭活菌丝体红花大金元 cdna文库 SSH cdna序列

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日本血吸虫分泌型抗原T细胞表位的预测研究

日本血吸虫分泌型抗原T细胞表位的预测研究

作者：隋传宇上海师范大学

学位级别：硕士

获得高效安全的疫苗一直是血吸虫病控制研发领域中亟待解决的热点和难点问题之一。大量免疫机制研究表明：在辐照致弱尾蚴免疫小鼠等动物模型中，其诱导的高保护力主要是由CD4+T细胞介导的细胞免疫。筛选到上述模型中发挥保护性细胞免... 详细信息

获得高效安全的疫苗一直是血吸虫病控制研发领域中亟待解决的热点和难点问题之一。大量免疫机制研究表明：在辐照致弱尾蚴免疫小鼠等动物模型中，其诱导的高保护力主要是由CD4+T细胞介导的细胞免疫。筛选到上述模型中发挥保护性细胞免疫效应作用的分子或者T细胞表位，应当是血吸虫疫苗研究的可能的突破点之一。而基于可靠的免疫信息学实验与理论的反向疫苗学技术与常规方法相比，可以节省大量的实验时间和经费，可能成为快速发现血吸虫保护性T细胞抗原或表位的有力工具。应用反向疫苗学策略快速有效地发现保护性抗原和表位要解决的关键问题主要有：怎样从大量序列中筛查出可能的候选分子;怎样准确地进行MHC结合肽的预测。本研究以116个日本血吸虫全长cdna序列和71个EST序列为样本，围绕解决上述二个关键技术问题开展工作，研究内容包括候选序列的注释与分析以及T细胞表位的预测和初步鉴定。准确地识别出DNA序列的蛋白质编码区是开展T细胞表位筛选工作的前提。鉴于目前还没有供一般实验室使用的标准程序来进行日本血吸虫DNA序列的蛋白质编码区的识别，使得各实验室所提交的序列的编码区识别出现一些差异，本研究将基于序列内部特征的序列谱分析和马尔科夫模型等方法与基于序列外部特征的方法如编码区起始位点和终止位点的识别等相结合，即采用多服务器综合分析流程，对上述样本序列进行了分析。对116条全长cdna序列的预测结果表明，仅有5％的序列(6条)与中国国家人类基因组南方研究中心(以下称南方中心)的预测结果完全不同;有8.6％(及1.7％)的序列的预测读码框与南方中心预测的相同，但长度短于(及长于)南方中心注释结果;其余预测结果与南方中心注释的完全相同。对71条EST序列组装后得到非冗余的51条EST序列，成功地用上述流程对其进行了蛋白质编码区的识别。提示本研

关键词：日本血吸虫 cdna序列表达序列标签分泌型分子 T细胞表位预测反向疫苗学

中国捕鸟蛛毒素的基因克隆、表达及结构与功能关系的研究

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中国捕鸟蛛毒素的基因克隆、表达及结构与功能关系的研究

作者：唐建洲湖南师范大学

学位级别：硕士

虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena Wang)是分布在我国广西省和云南省山区的一种稀有蜘蛛新种,在本实验室以前的工作中,从虎纹捕鸟蛛的粗毒中分离出了具有不同结构和功能的多种成分,并且已经克隆了其中9种毒素的cdna,将其分为三个超家族... 详细信息

虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena Wang)是分布在我国广西省和云南省山区的一种稀有蜘蛛新种,在本实验室以前的工作中,从虎纹捕鸟蛛的粗毒中分离出了具有不同结构和功能的多种成分,并且已经克隆了其中9种毒素的cdna,将其分为三个超家族。本文采用RACE方法克隆了HWTX-Ⅴ的cdna,并将其归类于超家族中。根据毒素的氨基酸序列设计RACE引物,通过叠合3’RACE和5’RACE扩增的序列就得到了毒素蛋白的cdna全序列。HWTX-Ⅴ的全长cdna共有459个碱基。由5’UTR、可读框和3’UTR组成,将其与其它虎纹捕鸟蛛的毒素(HWTX-Ⅰ,HWTX-Ⅱ,HWTX-Ⅲ,HWTX-Ⅳ,HWTX-Ⅶ)cdna进行同源比较,同时将Pre和Pro区与其他已知毒素的Pre和Pro区比较,结果表明HWTX-Ⅴ的核苷酸序列在Pre和Pro区与HWTX-Ⅰ,HWTX-Ⅲ,HWTX-Ⅳ高度同源,而与HWTX-Ⅱ,HWTX-Ⅶ的同源性较低。由此可知HWTX-Ⅴ,HWTX-Ⅰ,HWTX-Ⅳ属同一超家族,从而可以预测HWTX-Ⅴ的三级结构同HWTX-Ⅰ一样,六个半胱氨酸残基都通过C1-C4,C2-C5,C3-C6的配对方式形成抑制剂半胱氨酸结模体(inhibitor Cystine knot,ICK)。HWTX-Ⅴ的cdna可读框编码86个氨基酸残基的毒素前体,包括N端的50个氨基酸残基组成的信号肽和间隔区,中间35个氨基酸残基组成的成熟毒素,以及C端的额外碱性氨基酸Lys。尾端的Lys在毒素前体的成熟过程中被切除。敬钊缨毛蛛(Chilobrachis jingzhao)属于捕鸟蛛科,是分布于我国海南省山区的一种蜘蛛新种。本实验室以前的工作中,已经测定了约20种毒素的一级结构。本文采用RACE方法克隆了5种敬钊缨毛蛛的全长cdna序列,它们都由5’UTR、可读框和3’UTR组成,其开放阅读框编码一个20-23个氨基酸残基组成的信号肽区域,一个30多个氨基酸残基组成的成熟蛋白区域和一个介于它们之间的pro区域构成的毒素前体。这几种毒素的pro区变化较大,从几个氨基酸残基(JZTX-Ⅰ,Ⅲ,Ⅶ)到30多个(JZTX-Ⅸ)氨基酸残基不等,且它们的同源性较低。蜘蛛毒素蛋白由于其序列短而富含二硫键,所以采用基因工程的方法表达困难,本文采用原核分泌表达载体pMAL-p2X成功表达了HWTX-Ⅳ,

关键词： RACE cdna序列虎纹捕鸟蛛毒素V 表达与纯化毒素组学 TTX敏感型钠通道

微囊藻毒素对3种淡水鱼肝脏HSP70基因转录水平的影响

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微囊藻毒素对3种淡水鱼肝脏HSP70基因转录水平的影响

作者：叶觉秋暨南大学

学位级别：硕士

随着社会工业化进程的加快,大量含氮、磷的污染物被排放入自然水体中,加速了水体的富营养化,引发全球性的环境污染问题。本文研究内容主要为微囊藻毒素(MC-LR)对淡水鱼类肝脏热休克蛋白(HSP70)基因诱导表达水平之影响。以三种淡水鱼:鲢... 详细信息

随着社会工业化进程的加快,大量含氮、磷的污染物被排放入自然水体中,加速了水体的富营养化,引发全球性的环境污染问题。本文研究内容主要为微囊藻毒素(MC-LR)对淡水鱼类肝脏热休克蛋白(HSP70)基因诱导表达水平之影响。以三种淡水鱼:鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix),草鱼(Ctenopharyngodon idellus),及尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica),对MC-LR的耐受性依次排列为尼罗罗非鱼、鲢鱼、草鱼,比较其处于微囊藻毒素造成的氧化压力下,肝脏HSP70的诱导表达水平。实验通过简并引物PCR从鲢鱼、草鱼及尼罗罗非鱼的肝脏克隆HSP70基因cdna核心序列,并应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增出它们的5′末端和3′末端序列而获得其cdna全序列。序列分析表明,它们的HSP70基因cdna全序列分别为2356bp、2346 bp及2242 bp,其中鲢鱼及草鱼的开放阅读框(ORF)均为1950 bp、编码649个氨基酸,而尼罗罗非鱼的ORF则为1917 bp,编码638个氨基酸。通过对上述三种淡水鱼(6-13)g活体腹腔注射亚致死量MC-LR(50μg kg bwt)8h后,发现微囊藻毒素对尼罗罗非鱼肝脏HSP70基因表达有显著的诱导作用(P＜0.05),然而鲢鱼肝脏HSP70基因mRNA表达水平虽出现明显的升势,但未出现显著的诱导作用(P＞0.05),草鱼的则保持不变,即微囊藻毒素可能对草鱼肝脏HSP70基因mRNA的表达未能起到诱导作用。肝脏HSP70基因在微囊藻毒素的诱导作用下,其表达水平与对MC-LR的耐受性有着明显的相关性,对MC-LR有较高抵抗能力的鱼类(尼罗罗非鱼)其诱导表达水平最为显著,其次为抵抗能力一般的鱼类(鲢鱼),而对毒素较感敏的鱼类(草鱼)则本身没有改变。因此我们认为在淡水鱼类中,肝脏HSP70基因mRNA之诱导表达水平可能与微囊藻毒素之耐受性有关。另外,本实验亦克隆出斜带石斑鱼(Epinephelus coioides),鳙鱼(Aristichthysmobilis),鲫鱼(Carasslius auratus),白云金丝(Tanichthys albonubes),中华鲟(Acipensersturio Linnaeus),多鳍鱼(Polypterus senegalus Cuvier),斑鳢(Channa maculata)等鱼类HSP70基因的部份cdna序列。

关键词：热休克蛋白70 cdna序列基因克隆微囊藻毒素基因表达淡水鱼

重症肌无力P9-ZFD蛋白的骨骼肌亚细胞定位

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中国神经科学杂志 2003年第5期19卷 308-312页

作者：任明山吕传真乔健任惠民徐韧甘仁宝复旦大学附属华山医院神经内科上海200040 中国科学院上海细胞生物化学研究所上海200031

目的 :表达、纯化重症肌无力相关P9基因TRAF型锌指结构 (P9TRAF typezincfingerdomain ,简称P9 ZFD)编码的蛋白质 ,制备P9 ZFD多克隆抗体 ,研究P9 ZFD蛋白的骨骼肌亚细胞定位。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR )克隆编码P9 ZFD... 详细信息

目的 :表达、纯化重症肌无力相关P9基因TRAF型锌指结构 (P9TRAF typezincfingerdomain ,简称P9 ZFD)编码的蛋白质 ,制备P9 ZFD多克隆抗体 ,研究P9 ZFD蛋白的骨骼肌亚细胞定位。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR )克隆编码P9 ZFD的cdna序列 ,构建pET2 4a P9 ZFD表达载体 ,在E .coliBL2 1(DE3)中胞内诱导表达P9 ZFD蛋白 ,组氨酸亲和色谱法纯化P9 ZFD蛋白并免疫Balb/c小鼠制备其多克隆抗体。ELISA和Westernblot鉴定抗体效价及其免疫特异性。免疫组织化学及免疫电镜观察P9 ZFD蛋白在骨骼肌中的表达部位及其亚细胞分布。结果 :表达、纯化的P9 ZFD蛋白相对分子质量约 30kD ,纯度达 95 %以上。制备的P9 ZFD抗体具有特异的免疫反应性。免疫组织化学和免疫电镜结果显示 ,P9 ZFD蛋白的免疫染色部位集中沿MG骨骼肌细胞膜分布。结论 :重症肌无力相关的P9 ZFD蛋白在MG骨骼肌细胞膜处表达 ,是一种骨骼肌细胞膜蛋白组分。

关键词：重症肌无力 P9-ZFD蛋白骨骼肌亚细胞定位制备逆转录-聚合酶链反应 cdna序列

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虾夷扇贝MyTRAF6基因的克隆、启动子及表达分析

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虾夷扇贝MyTRAF6基因的克隆、启动子及表达分析

作者：汪洋辽宁师范大学

学位级别：硕士

虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)是一种重要的经济贝类，广泛分布在朝鲜半岛北部，日本北部岛屿的沿岸，北方四岛以及库页岛。自1982年虾夷扇贝从日本引进到中国以来，虾夷扇贝的养殖业的发展迅速。几年来，由于近亲繁殖、海水污染... 详细信息

虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)是一种重要的经济贝类，广泛分布在朝鲜半岛北部，日本北部岛屿的沿岸，北方四岛以及库页岛。自1982年虾夷扇贝从日本引进到中国以来，虾夷扇贝的养殖业的发展迅速。几年来，由于近亲繁殖、海水污染和放养密度增加，爆发了虾夷扇贝的大量死亡。这不仅给虾夷扇贝的养殖业带来巨大的经济损失，也严重影响了水产养殖的稳定发展。肿瘤坏死因子相关受体因子6（TRAF6）是肿瘤坏死因子家族和Toll-like/interleukin-1家族的重要接头分子。在先天性免疫和获得性免疫中起着重要的作用。确定虾夷扇贝的TRAF6基因（本文命名为：MyTRAF6）并对其特点进行研究。利用3′RACE扩增出MyTRAF6基因的cdna全长有2407bp，其中包括239bp的5′非编码区;1974bp的开放阅读框，编码了657个氨基酸;194bp的3′非编码区，包括多腺苷酸化信号序列AATAAA和一个poly(A)尾巴。MyTRAF6的氨基酸序列包括一个环形锌指、两个TRAF-型锌指和一个MATH(meprin and TRAF homology)结构。多序列比对结果发现，与海湾扇贝的TRAF6相似度最高达到96%;与火鸡的TRAF6相似度最低仅有43%。系统发生树能够清楚发现MyTRAF6的同源性。采用基因组步移（Genome Walking）的方法确定了MyTRAF6的启动子区域，全长为1462bp。通过TRANSFAC和AliBata2.1软件预测出MyTRAF6启动子序列中的假定转录因子结合位点。利用多序列比对方法比对了15个虾夷扇贝MyTRAF6的启动子序列发现了3个SNP位点，分别为615(C/G),553(T/C)和419(G/A)。615C/G和419G/A特定的等位基因，转录因子结合位点的没有变化。553T/C特定的等位基因，一个假定的转录因子结合位点出现在特定的T等位基因，但是不存在于特定的C等位基因。利用实时定量PCR（Real-time PCR）技术检测MyTRAF6基因在不同组织和鳗弧菌（Vibrillo anguillarum）注射后各时间段的相对表达量。结果发现MyTRAF6在血细胞中的表达量最高;鳗弧菌注射6h后，MyTRAF6在血细胞中的转录水平达到最大值。根据结果可以推测：虾夷扇贝在抵御细菌感染时，MyTRAF6起着重要的作用。可能是软体动物先天性免疫的调节分子。本实验加深了我们对虾夷扇贝的先天性免疫的理解，同时离我们找到一种对付虾夷扇贝养殖疾病的方法的最终目标更近一步。

关键词：虾夷扇贝肿瘤坏死因子相关受体因子6 cdna序列 mRNA表达启动子分析SNP

MMP-9反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

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山东医药 2005年第16期45卷 13-14页

作者：唐琳陈奎生张岚张云汉高冬玲河南省肿瘤病理重点实验室河南郑州450052 郑州大学第一附属医院

目的构建MMP-9反义RNA真核表达载体。方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索的MMP-9基因cdna序列,设计并合成反义MMP-9基因片段引物,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),先将扩增产物克隆至pGEM-T载体,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pc... 详细信息

目的构建MMP-9反义RNA真核表达载体。方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索的MMP-9基因cdna序列,设计并合成反义MMP-9基因片段引物,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),先将扩增产物克隆至pGEM-T载体,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcdna3.1中,然后对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的MMP-9反义RNA表达质粒pcdna3.1-MMP-9分别作PCR及双酶切(BamH和Hind)鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与反义MMP-9序列设计完全一致。结论成功构建了MMP-9反义RNA真核表达载体pcdna3.1-MMP-9,为进一步研究MMP-9蛋白分子的生物学功能和以MMP-9为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。

关键词：真核表达载体逆转录聚合酶链反应反义RNA表达质粒 pcdna3.1 MMP-9基因 cdna序列真核表达质粒 PCR扩增 BamHⅠ 生物学功能总RNA 胃癌组织扩增产物基因片段测序分析酶切鉴定阳性克隆序列设计插入片段基因治疗

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