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Structural insights into the regulatory mechanism of the Pseudomonas aeruginosa YfiBNR system

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Protein & cell 2016年第6期7卷 403-416页

作者： Min Xu Xuan Yang Xiu-An Yang Lei Zhou Tie-Zheng Liu Zusen Fan Tao Jiang National Laboratory of Biomacromolecules Institute of Biophysics Chinese Academy of Sciences Beijing 100101 China chinese Academy of Sciences Key Laboratory of Infection and Immunity Institute of Biophysics Chinese Academy of Sciences Beijing 100101 China University of chinese Academy of Sciences Beijing 100049 China

YfiBNR is a recently identified bis-（3＇-5＇）-cyclic dimeric gmp （c-di-gmp） signaling system in opportunistic pathogens. It is a key regulator of biofilm formation, which is correlated with prolonged persistence of infection and antibiotic drug resistance. In response to cell stress, YfiB in the outer membrane can sequester the pariplasmic protein YfiR, releasing its inhibition of YfiN on the inner membrane and thus provoking the diguanylate cyclase activity of YfiN to induce c-di-gmp production. However, the detailed regulatory mechanism remains elusive. Here, we report the crystal struc- tures of YfiB alone and of an active mutant YfiB^L43P complexed with YfiR with 2：2 stoichiometry. Structural analyses revealed that in contrast to the compact conformation of the dimeric YfiB alone, YfiB^L43P adopts a stretched conformation allowing activated YfiB to penebate the peptidoglycan （PG） layer and access YfiR. YfiBL43P shows a more compact PG-binding pocket and much higher PG binding affinity than wild-type YflB, suggesting a tight correlation between PG binding and YfiB activation. In addition, our crystallographic analyses revealed that YflR binds Vitamin B6 （VB6） or L-Trp at a YfiB-binding site and that both VB6 and L-Trp are able to reduce YfiBL43P-induced biofilm formation. Based on the structural and biochemical data, we propose an updated regulatory model of the YfiBNR system.

关键词： the YfiBNR system c-di-gmp Vitamin B6,L-Trp peptidoglycan layer bioflim formation

美罗培南对胞内不同c-di-gmp浓度表型铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响

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广西医科大学学报 2020年第6期37卷 1001-1006页

作者：谢杰鹏孔晋亮陈一强王可罗劲张真强刘冬梅广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科南宁530021

目的:探究美罗培南对胞内不同环二鸟苷酸(c-di-gmp)浓度表型铜绿假单胞菌(PA)生物被膜形成的影响。方法:两倍稀释法测定美罗培南对各菌株的抑菌浓度(MIc);设阴性对照组和3个美罗培南干预组(1/2MIc、1/4MIc、1/8MIc)。用1/2MIc、1/4MIc、... 详细信息

目的:探究美罗培南对胞内不同环二鸟苷酸(c-di-gmp)浓度表型铜绿假单胞菌(PA)生物被膜形成的影响。方法:两倍稀释法测定美罗培南对各菌株的抑菌浓度(MIc);设阴性对照组和3个美罗培南干预组(1/2MIc、1/4MIc、1/8MIc)。用1/2MIc、1/4MIc、1/8MIc的美罗培南分别干预野生株PAO1、PA胞内c-di-gmp高表达株(PAO1ΔwspF)、PA胞内c-di-gmp低表达株(PAO1/Plac-yhjH),观察美罗培南对其运动能力的影响,用结晶紫染色法测定美罗培南对PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH菌株的生物被膜形成以及对生物被膜清除能力的影响。结果:在美罗培南的干预下,PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH的运动区域直径均比阴性对照组小(Pc-yhjH的运动能力以及生物被膜形成,美罗培南能破坏PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH形成的生物被膜,美罗培南对PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH的抑制效果不同。

关键词：美罗培南 c-di-gmp 铜绿假单胞菌生物被膜

解淀粉芽孢杆菌PG12中c-di-gmp受体YdaK的功能初探

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解淀粉芽孢杆菌PG12中c-di-GMP受体YdaK的功能初探

中国植物病理学会2021年学术年会

作者：龚慧玲张悦杨攀雷赵羽王琦李燕中国农业大学植物保护学院

c-di-gmp是细菌中广泛存在的第二信使,通过与特异性受体结合调控细菌不同生理功能,如生物膜形成、运动性、毒力等。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PG12菌株是本课题组从苹果中分离获得对苹果轮纹病表现出良好防效的有益细... 详细信息

c-di-gmp是细菌中广泛存在的第二信使,通过与特异性受体结合调控细菌不同生理功能,如生物膜形成、运动性、毒力等。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PG12菌株是本课题组从苹果中分离获得对苹果轮纹病表现出良好防效的有益细菌,产生脂肽类化合物Iturin A和Fengycins是其重要的生防机制。前期研究结果显示c-di-gmp负调控PG12的运动能力,正调控PG12薄皮型生物膜的形成,同时正调控PG12对苹果轮纹病的防病效果,但对轮纹病菌的拮抗活性没有影响。由于生物膜的形成有利于生防菌定殖于植物表面影响其防病效果,因此推测c-di-gmp通过影响生物膜形成从而调控PG12对苹果轮纹病的防病作用。YdaK是一类退化的GGDEF结构域蛋白,在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)3610中YdaK作为c-di-gmp受体在过量表达时调控细菌一种EPS的产生,影响生物膜形成。PG12中YdaK与3610中YdaK蛋白同源性较高,为明确PG12中YdaK是否作为c-di-gmp受体调控生物膜进而调控防病活性,本研究通过基因敲除、功能互补等功能基因组学研究方法,探究菌株PW2中YdaK对其生物膜形成、运动性及防病活性的影响。本研究首先利用同源重组技术构建ydaK的单缺失突变体ΔydaK,然后在解淀粉芽孢杆菌中c-di-gmp代谢酶缺失菌株ΔyuxH、ΔyhcK、ΔytrP的基础上缺失ydaK,即构建双缺失菌株ΔyuxHΔydaK、ΔyhcKΔydaK、ΔytrPΔydaK。生物膜形成能力检测结果显示:单缺失敲除突变体的薄皮型生物膜的形成能力没有区别,过表达ytrP的菌株生物膜形成能力增强,过表达yuxH的菌株生物膜形成能力减弱,将过表达的ytrP的GGDEF结构域缺失或将yuxH的EAL结构域缺失后,过表达菌株生物膜形成能力恢复,说明c-di-gmp影响PG12薄皮型生物膜的形成。双缺失菌株的薄皮型生物膜(pellicle)和菌落生物膜(colony)的形成能力与野生型菌株和单缺失菌株没有显著差异,说明敲除ydaK不影响PG12生物膜的形成,推测YdaK与YdaK一致,需在过量表达时发挥对生物膜的调控作用。通过对单缺失和双缺失菌株及功能互补菌株的运动性进行检测发现:ΔyhcK和ΔytrP的运动性比对照增强,说明低浓度c-di-gmp促进运动性。而ΔyuxH的运动性和对照相比减弱,说明高浓度c-di-gmp使运动性减弱。菌株ΔydaK和对照相比无显著差异,但过表达ydaK时,菌株运动性显著下降。由于YdaK是退化的GGDEF结构域蛋白,没有合成c-di-gmp的功能,说明其可能作为受体影响运动性。通过分别使用ytrP和yuxH的过表达菌株以及ΔydaK对苹果轮纹病进行生测实验后发现:过表达yuxH的菌株对苹果轮纹病的防病效果显著降低,单缺失ydaK和对照相比无显著差异。这说明敲除YdaK不影响c-di-gmp调控苹果轮纹病的防病过程,推测YdaK需要在过量表达时发挥对苹果轮纹病的防病作用。同时说明c-di-gmp正调控PG12对苹果轮纹病的防病效果,该影响和生物膜的形成能力成正相关,推测可能是生物膜形成能力对PG12在苹果果实上的定殖起到了关键作用。本研究结果探究了c-di-gmp受体YdaK对解淀粉芽孢杆菌PG12生物膜形成、运动性及防病活性的影响,并首次揭示了YdaK在运动性上的功能,为进一步探究解淀粉芽孢杆菌PG12在防治苹果轮纹病的生防机制上提供理论基础。

关键词：解淀粉芽孢杆菌 c-di-gmp 运动性生物膜

病原细菌第二信使c-di-gmp核糖开关的鉴别

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病原细菌第二信使c-di-GMP核糖开关的鉴别

中国植物病理学会2009年学术年会

作者：管文静吴茂森陈华民何晨阳中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室

＜正＞1细菌基因表达调控细菌需要迅速有效地对控制细胞各种功能的基因进行严密调控,以适应不断变化的环境条件。最早认识到的是调控蛋白对基因转录起始的控制。这些蛋白影响到RNA聚合酶与目标基

关键词： c-di-gmp 核糖开关 GEMM基序基因表达转录后调控

Interplay between the bacterial protein deacetylase cobB and the second messenger c-di-gmp

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Interplay between the bacterial protein deacetylase CobB and...

中国生物工程学会第十三届学术年会暨2019年全国生物技...

作者： Zhaowei Xu Hainan Zhang Xingrun Zhang Hewei Jiang chengxi Liu Fanlin Wu Lili Qian Bingbing Hao Daniel M czajkowsky Shujuan Guo Zhijing Xu Lijun Bi Shihua Wang Haitao Li Minjia Tan Wei Yan Lei Feng Jingli Hou Sheng-ce Tao Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education) Shanghai Center for Systems Biomedicine Shanghai Jiao Tong University MOE Key Laboratory of Protein Sciences Center for Structural Biology School of Life Sciences Tsinghua University Department of Basic Medical Sciences School of Medicine Tsinghua University The chemical Proteomics center and State Key Laboratory of Drug Research Shanghai Institute of Materia Medica Chinese Academy of Sciences School of Biomedical Engineering Shanghai Jiao Tong University college of Life Sciences Shanghai Normal University National Key Laboratory of Biomacromolecules Key Laboratory of Non-Coding RNA and Key Laboratory of Protein and Peptide Pharmaceuticals Institute of Biophysics Chinese Academy of Sciences School of Stomatology and Medicine Foshan University School of Life Science Fujian Agriculture and Forestry University Instrumental Analysis center Shanghai Jiao Tong University State Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes

As a ubiquitous bacterial secondary messenger, c-di-gmp plays key regulatory roles in processes such as bacterial motility and transcription regulation. cobB is the Sir2 family protein deacetylase that controls energy metabolism, chemotaxis, and DNA supercoiling in many bacteria. Using an Escherichia coli proteome microarray, we found that c-di-gmp strongly binds to cobB. Further, protein deacetylation assays showed that c-di-gmp inhibits the activity of cobB and thereby modulates the biogenesis of acetyl-coA. Interestingly, we also found that one of the key enzymes directly involved in c-di-gmp production, DgcZ, is a substrate of cobB. Deacetylation of DgcZ by cobB enhances its activity and thus the production of cdi-gmp. Our work establishes a novel negative feedback loop linking c-di-gmp biogenesis and cobB-mediated protein deacetylation.

关键词： c-di-gmp cobB diguanylate cyclase negative feedback loop protein acetylation

防病枯草芽孢杆菌GLB191中c-di-gmp对生物膜的影响

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防病枯草芽孢杆菌GLB191中c-di-GMP对生物膜的影响

中国植物病理学会2021年学术年会

作者：杨攀雷段雍明龚慧玲赵羽王琦李燕中国农业大学植物保护学院

环二鸟苷单磷酸（cyclic diguanylate,c-di-gmp）是细菌中普遍存在的第二信使信号分子,参与调控细菌运动性、生物膜形成等多种生理功能。细菌中c-di-gmp浓度是由含有GGDEF结构域的合成酶（DGc）及具有EAL或HD-GYP结构域的降解酶（PDE）... 详细信息

环二鸟苷单磷酸（cyclic diguanylate,c-di-gmp）是细菌中普遍存在的第二信使信号分子,参与调控细菌运动性、生物膜形成等多种生理功能。细菌中c-di-gmp浓度是由含有GGDEF结构域的合成酶（DGc）及具有EAL或HD-GYP结构域的降解酶（PDE）调控,c-digmp分子与特异性受体结合调控特异的生物学功能。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中含有3个DGc （DgcK/DgcP/DgcW）和1个PDE （PdeH）,以及3个c-di-gmp受体（YdaK/YkuI/DgrA）,已经明确c-di-gmp调控细菌的运动性和菌落型生物膜。然而,单独敲除或过表达cdi-gmp的合成酶或降解酶编码基因均不影响薄皮型和colony生物被膜的形成;只有过表达DgcW-ΔEAL结构域或在过表达ydaK-N操纵子的背景下敲除DGc编码基因才能引起生物膜的改变。为明确枯草芽孢杆菌的不同菌株是否存在差异,本研究以对葡萄霜霉病具有良好防效的防病枯草芽孢杆菌GLB191为材料,探究c-di-gmp与生物膜形成的关系。研究结果显示,单敲除DGc或PDE编码基因均不影响colony生物膜的形成,与已经报道的结果一致;但在野生菌株背景下分别过表达3个DGc编码基因dgcKdgcP、dgcW、dgcW-ΔEAL和dgcW-ΔGGDEF,菌株的生物膜形成能力较野生菌株均显著增强,这与已经报道的结果差异较大。上述结果表明:c-digmp促进GLB191的生物膜形成能力,但c-di-gmp影响生物膜的功能受到胞内c-di-gmp阈值的调节,枯草芽孢杆菌不同菌株可能存在差异。该结果将为明确c-di-gmp调控枯草芽孢杆菌生物膜形成机制以及防病机理奠定基础。

关键词：防病枯草芽孢杆菌GLB191 c-di-gmp 生物膜

水稻白叶枯病菌群体感应信号DSF和c-di-gmp系统中重要基因的鉴定和功能分析

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水稻白叶枯病菌群体感应信号DSF和c-di-GMP系统中重要基因的鉴定...

中国植物病理学会2009年学术年会

作者：孙蕾吴茂森陈华民何晨阳中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室

＜正＞对病原细菌群体感应（QS）信号系统及其调控网络的研究,有利于解析其致病性/毒性机理,为发展新型、有效和可持续的病害控制策略提供科学依据。然而,至今对水稻白叶枯病菌

关键词：水稻白叶枯病菌群体感应 DSF c-di-gmp 毒性调控途径

不同c-di-gmp水平对于comamonas testosteroni细胞表面理化性质的影响

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不同c-di-GMP水平对于Comamonas testosteroni细胞表面理化性质的...

2019年中国土壤学会土壤环境专业委员会、土壤化学专业委员会联合学术研讨会

作者：杨闪闪吴一超高春辉何怡壮黄巧云蔡鹏华中农业大学农业微生物学国家重点实验室/资源与环境学院

[目的]c-di-gmp是细菌中普遍存在的第二信使,其调节生物膜形成的功能已被广泛研究。但不同c-di-gmp水平对于细胞表面物理化学性质的影响尚未见报道。[方法]本研究通过外源导入c-di-gmp合成酶或水解酶质粒,构建不同c-di-gmp水平的睾丸酮... 详细信息

[目的]c-di-gmp是细菌中普遍存在的第二信使,其调节生物膜形成的功能已被广泛研究。但不同c-di-gmp水平对于细胞表面物理化学性质的影响尚未见报道。[方法]本研究通过外源导入c-di-gmp合成酶或水解酶质粒,构建不同c-di-gmp水平的睾丸酮丛毛单胞菌(comamonas testosterone WDL7)。利用原子力显微镜、自动电位滴定仪、接触角测量仪和Zeta电位分析仪等技术表征

关键词： c-di-gmp 睾丸酮丛毛单胞菌生物膜粘性疏水性负电性

铜绿假单胞菌二鸟苷酸环化酶SiaD激活和反馈调节机制研究

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铜绿假单胞菌二鸟苷酸环化酶SiaD激活和反馈调节机制研究

作者：霍卫萍西北大学

学位级别：硕士

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是自然界中广泛分布的革兰氏阴性菌,也是一种常见的条件致病菌,能造成急性感染和慢性感染。环二鸟苷磷酸(cyclic-di-gmp,c-di-gmp)是铜绿假单胞菌在急、慢性感染转化过程中的重要信号分子。我... 详细信息

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是自然界中广泛分布的革兰氏阴性菌,也是一种常见的条件致病菌,能造成急性感染和慢性感染。环二鸟苷磷酸(cyclic-di-gmp,c-di-gmp)是铜绿假单胞菌在急、慢性感染转化过程中的重要信号分子。我们之前的研究已经证明,siaABcD操纵子编码一个信号网络,该网络通过调节SiaD的酶活性,来控制生物被膜和聚集体的形成。Siac通过蛋白质间的相互作用,激活SiaD二鸟苷酸环化酶(DGc)的活性。然而,Siac激活SiaD的机制仍不清楚。另外,同源物结构比对发现,SiaD具有典型的c-di-gmp反馈抑制位点,主要包括I-位点和富含精氨酸的N-末端。我们推测丰富的精氨酸与c-di-gmp的结合有关,SiaD存在类似于PleD的反馈调节模式。本论文首先研究了Siac-SiaD相互作用的分子机制,通过生物被膜形成实验和酶活的测定,重新定义了siaD基因的编码序列;前期与上海交通大学合作解析的Siac-SiaD复合物的晶体结构中发现了SiaD中Siac的四个结合基序,我们通过亲和下拉实验(GST-pull down)实验和尺寸排阻色谱实验(SEc)结果证明SiaD中Siac的四个结合基序的突变不影响Siac-SiaD蛋白的结合;生物被膜形成实验和酶活的测定实验证明,Siac结合基序SiaD的突变对Siac-SiaD复合物的功能有更大的影响。然后我们对SiaD蛋白构象进行研究,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验证明SiaD在溶液中以五聚体的形式存在,与SEc的数据一致;通过GST-pull down证明N-末端结构域在SiaD五聚体中发挥着关键的作用;通过圆二色谱实验(circular dichroism,cD),证明了SiaD由五聚体到二聚体二级结构的变化。最后我们对c-di-gmp反馈调节SiaD酶活性的机制进行研究,通过生物被膜形成实验和酶活的测定实验证明,反馈抑制位点R201的突变对SiaD蛋白的功能有更大的影响;高效液相色谱实验数据分析显示,在激活和非激活状态下,c-di-gmp对SiaD都有抑制作用,而I位点R201的突变解除了这两种状态下的反馈抑制。此外,在研究过表达siaD对生物被膜的调控作用时,我们发现了siaD的基因突变体,通过生物被膜形成实验以及HPLc实验,证明R119的突变与反馈调节机制无关;最后我们通过泳动实验发现,R119M突变导致该菌株的泳动能力变弱。综上所述,对铜绿假单胞菌二鸟苷酸环化酶SiaD激活和反馈调节机制的研究,拓展了我们对GGDEF调控的理解,为阐明二鸟苷酸环化酶家族调控的分子机制提供了新的起点。

关键词：铜绿假单胞菌生物被膜 c-di-gmp 激活机制反馈调节机制