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细菌c-di-amp特异性磷酸二酯酶的研究进展

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科学通报 2022年第22期67卷 2627-2637页

作者：张颖徐兆坤罗海霞郝秀静李敏宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室银川750021

c-di-amp特异性磷酸二酯酶(c-di-amp-specific phosphodiesterase,PDE)是一类能够将c-di-amp水解为线性pApA或amp的酶,对维持细菌体内c-di-amp的代谢平衡至关重要.在不同的细菌中存在着不同结构类型的PDE,其功能既具有一定的保守性,又... 详细信息

c-di-amp特异性磷酸二酯酶(c-di-amp-specific phosphodiesterase,PDE)是一类能够将c-di-amp水解为线性pApA或amp的酶,对维持细菌体内c-di-amp的代谢平衡至关重要.在不同的细菌中存在着不同结构类型的PDE,其功能既具有一定的保守性,又存在特异性.c-di-amp作为第二信使分子在包括古菌、革兰氏阳性菌及支原体、衣原体、蓝细菌等部分革兰氏阴性菌等在内的原核生物中发挥多种功能.近年来研究显示,PDE通过调节细菌中cdi-amp水平,进而调控细菌生长、生物被膜形成、细菌耐药性、细菌毒力和宿主细胞的免疫应答等生物学过程,是预防和治疗病原菌感染的重要潜在靶点,在疫苗研发及小分子药物筛选开发领域中具有极大的潜力.本文对近年来PDE分类、结构及生物学功能等方面进行综述,旨在为相关研究人员提供参考.

关键词：第二信使 c-di-amp 磷酸二酯酶结构与功能

细菌c-di-amp在宿主免疫中的作用研究

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四川大学学报（医学版） 2022年第6期53卷 1098-1103页

作者：吴沁蕊彭显周学东口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科成都610041

环状二聚腺苷-3′,5′-单磷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-amp)是细菌和古细菌中新发现的第二信使。通过直接与靶蛋白结合或影响靶蛋白表达,c-di-amp调节多种细菌的生理功能,包括维持渗透压、平衡中枢代谢、监测DNA损伤以... 详细信息

环状二聚腺苷-3′,5′-单磷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-amp)是细菌和古细菌中新发现的第二信使。通过直接与靶蛋白结合或影响靶蛋白表达,c-di-amp调节多种细菌的生理功能,包括维持渗透压、平衡中枢代谢、监测DNA损伤以及控制生物膜和孢子形成。作为一种新型病原体相关分子模式与宿主模式识别受体结合,通过激活干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING),诱导环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合酶(cyclic GMP-amp synthase,cGAS)-STING信号轴产生Ⅰ型干扰素,并通过核因子-κB信号通路促进炎症因子分泌,在宿主对细菌感染及肿瘤的免疫中发挥重要作用。因其良好的免疫原性,c-di-amp可作为免疫佐剂为疫苗的研发提供新的靶点。然而,对c-di-amp在宿主免疫中的具体作用机制有待进一步探索。本文介绍了c-di-amp的结构及生物学特性,总结了c-di-amp对宿主免疫应答调控的可能机制,同时跟进其作为免疫佐剂应用于临床的治疗新进展。研究c-di-amp的功能及对宿主免疫应答的作用机制可为临床上解决细菌耐药、感染控制、肿瘤防治以及疫苗开发提供新的思路。

关键词： c-di-amp 第二信使细菌感染肿瘤免疫佐剂

钩端螺旋体c-di-amp结合蛋白调控钾离子转运

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中华微生物学和免疫学杂志 2023年第6期43卷 451-457页

作者：戴欣珏姚丽琴陈婧胡玮琳江苏省宜兴市中医医院中心实验室宜兴214200

目的寻找和鉴定钩端螺旋体中编码第二信使c-di-amp结合蛋白KtrA,并探究c-di-amp-KtrA/B系统的功能及调控机制。方法采用PcR扩增ktrA基因并克隆入pET42a质粒获得pET42aktrA原核表达载体,将其转入表达宿主菌中获得表达rKtrA的工程菌E.coli... 详细信息

目的寻找和鉴定钩端螺旋体中编码第二信使c-di-amp结合蛋白KtrA,并探究c-di-amp-KtrA/B系统的功能及调控机制。方法采用PcR扩增ktrA基因并克隆入pET42a质粒获得pET42aktrA原核表达载体,将其转入表达宿主菌中获得表达rKtrA的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-ktrA。通过亲和层析法提纯上述工程菌表达的重组蛋白rKtrA后,运用BIAcore技术检测rKtrA与c-di-amp的结合能力。采用细菌双杂交法检测钩端螺旋体Ktr系统中KtrA与KtrB的结合能力以及外源c-di-amp对其结合的调控机制。通过在钾离子转运功能缺失大肠埃希菌LB2003株中回补相关基因,分析c-di-amp-KtrA/B通路功能。结果成功构建钩端螺旋体ktrA基因原核表达工程菌,纯化的rKtrA可与c-di-amp特异性结合;KtrA可与KtrB发生相互作用,该结合作用可被c-di-amp解离;KtrA/B系统参与调控钾离子的摄取,该系统功能受c-di-amp负调控。结论钩端螺旋体KtrA为c-di-amp结合蛋白,c-di-amp-KtrA/B系统参与调控钾离子的转运。

关键词：钩端螺旋体 c-di-amp 钾离子转运

牙龈卟啉单胞菌c-di-amp代谢相关基因的克隆及表达纯化

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华西口腔医学杂志 2015年第6期33卷 607-612页

作者：邱伟程兴群周学东李雨庆口腔疾病研究国家重点实验室华西口腔医院(四川大学) 成都610041

目的克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)中负责c-di-amp代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化。方法通过聚合酶链反应(PcR)克隆牙龈卟啉单胞菌ATcc33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将... 详细信息

目的克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)中负责c-di-amp代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化。方法通过聚合酶链反应(PcR)克隆牙龈卟啉单胞菌ATcc33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将目的基因片段与大肠杆菌表达质粒p ET28a连接,分别构建出重组表达质粒p ETpgn0523、p ET-pgn1187和p ET-pgn2003。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和鉴定。用镍离子金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化,BcA法检测目的蛋白的浓度。结果目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003扩增产物条带与预期大小一致。重组表达质粒p ET-pgn0523、p ET-pgn1187和p ET-pgn2003及其PcR产物琼脂糖凝胶电泳验证与预期大小相符,测序结果与Gen Bank中牙龈卟啉单胞菌ATcc33277国际标准菌株的基因序列100%一致。IPTG诱导后的菌体经SDS-PAGE检测得到3个大小分别为19.5×103、39.9×103、66.0×103的蛋白质增强条带,与预期大小相符。镍离子金属亲和层析柱纯化得到的蛋白与预期目的蛋白分子量一致,BcA法测定目的蛋白的浓度分别为0.708、0.523和0.861 mg·m L-1。结论本研究成功克隆并表达纯化了牙龈卟啉单胞菌c-di-amp代谢相关蛋白,得到了较高浓度和纯度的目的蛋白,为进一步探究牙龈卟啉单胞菌c-di-amp的生理功能及体内代谢途径奠定了基础。

关键词：牙龈卟啉单胞菌 c-di-amp 代谢基因表达纯化

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c-di-amp调控细菌生物被膜的形成

生物工程学报 2017年第9期33卷 1369-1375页

作者：彭显李继遥徐欣四川大学华西口腔医院口腔疾病研究国家重点实验室四川成都610041 四川大学华西口腔医院华西口腔医院牙体牙髓病科四川成都610041

细菌生物被膜是细菌持续性致病的重要机制。研究细菌生物被膜的形成和发展可为顽固性细菌感染防治提供新的思路与策略。环二腺苷酸c-di-amp(cyclic diadenosine monophosphate)是继c-di-GMP之后在细菌中新发现的一种核苷酸第二信使分子... 详细信息

细菌生物被膜是细菌持续性致病的重要机制。研究细菌生物被膜的形成和发展可为顽固性细菌感染防治提供新的思路与策略。环二腺苷酸c-di-amp(cyclic diadenosine monophosphate)是继c-di-GMP之后在细菌中新发现的一种核苷酸第二信使分子。研究发现,c-di-amp参与调节细菌多种生理功能,包括细菌生长代谢、生物被膜形成、细胞壁的合成以及细菌毒力因子等。本文综述了c-di-amp参与调控细菌生物被膜形成的不同方式及其分子机制。鉴于c-di-amp在调控细菌生物被膜中的重要性,其可作为抗细菌生物被膜感染新药研发的潜在靶点。

关键词：细菌生物被膜 c-di-amp c-di-GMP

第二信使分子c-di-amp调控细菌中钾离子转运的机制

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微生物学报 2017年第10期57卷 1434-1442页

作者：蔡霞何进华中农业大学生命科学技术学院农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

钾离子(K^+)是维持生命体存活的必需元素。原核生物进化出一系列K^+转运系统,如Kdp系统﹑Ktr系统和Trk系统等,来维持胞内相对恒定的K^+浓度。环二腺苷酸单磷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-amp)是新发现的第二信使分子,可以... 详细信息

钾离子(K^+)是维持生命体存活的必需元素。原核生物进化出一系列K^+转运系统,如Kdp系统﹑Ktr系统和Trk系统等,来维持胞内相对恒定的K^+浓度。环二腺苷酸单磷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-amp)是新发现的第二信使分子,可以与K^+转运系统中的KdpD、KtrA和TrkA结合。当胞内c-di-amp浓度高时,c-di-amp会与K^+转运蛋白结合,降低其转运活性。c-di-amp的靶标除蛋白质外,还有RNA元件,即c-di-amp的核糖开关。高浓度的c-di-amp与其核糖开关结合后,可抑制下游K^+转运蛋白编码基因,如kdp、ktr和trk操纵子以及kup基因的转录,从而调控K^+的转运。总之,胞内高浓度的c-di-amp抑制细菌对K^+的吸收。c-di-amp调控K^+转运机制的研究,不仅丰富了K^+转运的调控方式,而且也扩大了c-di-amp的调控范围,为细菌的利用与防治提供了新思路。

关键词： c-di-amp K+转运系统 K+转运受体/靶标核糖开关

结核分枝杆菌c-di-amp合成酶的表达和纯化以及小鼠多抗血清的制备

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中国病原生物学杂志 2015年第8期10卷 681-684,688页

作者：曹田宇吉思雨褚阳光王丽梅康健王立飞徐志凯柏银兰第四军医大学学员旅陕西西安710032 第四军医大学微生物学教研室陕西西安710032

目的表达和纯化结核分枝杆菌c-di-amp合成酶,并制备多克隆抗体,为研究c-di-amp在MTB生理过程中的作用奠定基础。方法从MTB基因组中PcR扩增c-di-amp合成酶Rv3586基因,构建原核表达载体,序列鉴定后,IPTG诱导目的基因表达,采用Western-blo... 详细信息

目的表达和纯化结核分枝杆菌c-di-amp合成酶,并制备多克隆抗体,为研究c-di-amp在MTB生理过程中的作用奠定基础。方法从MTB基因组中PcR扩增c-di-amp合成酶Rv3586基因,构建原核表达载体,序列鉴定后,IPTG诱导目的基因表达,采用Western-blot鉴定目的蛋白,并用离子亲和层析法纯化重组蛋白;用纯化蛋白经背部皮下免疫小鼠,收集小鼠血清,用免疫学方法测定抗体滴度及其特异性。结果 PcR成功扩增Rv3586基因,限制性酶切分析和序列测定结果表明成功构建原核表达载体;表达的重组c-di-amp合成酶蛋白分子质量大小约43ku,该蛋白可被抗His标签抗体和感染小鼠血清识别。用纯化蛋白免疫小鼠,初次免疫后抗体滴度可达1︰12 800,且该多克隆抗体可识别结核分枝杆菌和卡介苗c-di-amp合成酶。结论在E.coli中成功表达c-di-amp合成酶,并制备了多克隆抗体,可用于结核分枝杆菌c-di-amp生物学功能的进一步研究。

关键词：结核病结核分枝杆菌 c-di-amp 原核表达抗体

cyclic Bis(3'-5')diadenylic Acid (c-di-amp) Analogs Promote the Activities of Photosynthesis and Respiration of <i>chlamydomonas reinhardtii</i>

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American Journal of Plant Sciences 2014年第1期5卷 24-28页

作者： Takafumi Tezuka Hiroshi Shirouzu Keigo Ishida Noritaka Suzuki Takuya Matsuo Kin-ichi Oyama Setsuyuki Aoki Masaki Tsukamoto center for Gene Research Division of Biological Science Graduate School of Science Nagoya University Nagoya Japan chemical Instrumentation Facility Research Center for Materials Science Nagoya University Nagoya Japan Graduate School of Information Science Nagoya University Nagoya Japan

Physiological changes in the photosynthesis, respiration and cell division of chlamydomonas reinhardtii, a freshwater green alga, in response to adenine nucleotides were investigated. In advance of this investigation, two adenine nucleotides, di(2'-O-methyl)-cyclic bis(3'-5')diadenylic acid (1) and its N-benzoyl-protected analog 2 were synthesized from the commercially available adenosine phosphoramidite. The respective analogs significantly promoted the cell division (cell number) of c. reinhardtii strains 137c mt+ and BR mt+. Moreover, they significantly enhanced the O2 evolution (photosynthesis) and O2 uptake (respiration) of both strains. c-di-amp analogs seem to play an effective role as a physiological activator in planta.

关键词： c-di-amp O2 Evolution (Photosynthesis) O2 Uptake (Respiration) chlamydomonas reinhardtii

嗜热链球菌S-3中c-di-amp合成酶的功能研究

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嗜热链球菌S-3中c-di-AMP合成酶的功能研究

作者：范艺周上海理工大学

学位级别：硕士

环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-amp)是一种重要的第二信使分子,与特定受体蛋白或核糖开关结合,广泛调控细菌生长、钾稳态、渗透压平衡、细菌毒力、生物膜形成和DNA修复等生理功能。本实验室前期从自然发酵乳中筛选... 详细信息

环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-amp)是一种重要的第二信使分子,与特定受体蛋白或核糖开关结合,广泛调控细菌生长、钾稳态、渗透压平衡、细菌毒力、生物膜形成和DNA修复等生理功能。本实验室前期从自然发酵乳中筛选出高产胞外多糖的嗜热链球菌S-3,对其全基因组测序发现,嗜热链球菌含有c-di-amp合成酶的保守dis A＿N结构域。本文以预测的c-di-amp合成酶基因为研究对象,对其编码蛋白StDAc(Stheptococcus thermphilus DAc)功能解析,为阐明嗜热链球菌c-di-amp信号调控奠定基础。具体研究内容如下:(1)通过生物信息学分析,在嗜热链球菌S-3基因组中仅发现1个c-di-amp合成酶基因orf0696,对其编码蛋白StDAc通过NPSA、SWISS-MODEL和Modeller等软件进行二级结构预测和三维结构模拟。建立的StDAc三维模型通过Flexible docking与底物ATP或ADP分子对接,结果表明StDAc能与ATP(-362.68 kcal/mol结合能)或ADP(-468.47 kcal/mol结合能)结合催化合成c-di-amp,且StDAc更倾向于以ADP为底物。(2)通过超高效液相色谱-四级杆轨道阱质谱(UPLc-QEMS)分析嗜热链球菌S-3裂解液,确定嗜热链球菌胞内含有c-di-amp。大肠杆菌异源表达StDAcX后在细胞裂解液中检测到c-di-amp的存在,表明StDAc即为c-di-amp合成酶编码基因。构建c-di-amp高亲和力结合受体ydaO核糖开关与红色荧光蛋白(RFP)结合的重组载体ydaO-RBS-RFP,使细胞内c-di-amp浓度与红色荧光蛋白荧光强度相关联,实现c-di-amp的体内快速检测,过表达基因orf0696菌株荧光强度比对照提高18%(Pc-di-amp合成酶基因。(3)对c-di-amp合成酶基因orf0696及其相邻基因共转录情况分析表明,orf0696与基因ybb R、glm M、gtr A、trm K、nif3和zup T位于同一操纵子。菌株生长结果发现,过表达StDAc显著降低嗜热链球菌的比生长速率(Pc在低Na(c在高K(>200 m M)或Zn(>5μM)培养基中对嗜热链球菌生长无显著影响,但在低K培养基中迟滞时间缩短和倍增时间延长,在低Zn(3μM)培养基中显著提高比生长速率(Pc使嗜热链球菌胞外多糖产量下降22.0%(Pc-di-amp可能调控胞外多糖的生物合成。

关键词：嗜热链球菌 c-di-amp c-di-amp合成酶 ydaO核糖开关