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聚合R基因Pigm和非R基因bsr-d1改良水稻稻瘟病抗性

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华北农学报 2022年第5期37卷 157-165页

作者：王亚王越涛申关望王付华王生轩白涛尹海庆河南省农业科学院粮食作物研究所河南郑州450002 信阳市农业科学院水稻研究所河南信阳464000

综合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因芯片技术,聚合主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1,以改良优良食味水稻品种水晶3号的稻瘟病抗性。首先利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以bsr-d1为靶基因构建重组表达载体并通过农杆菌介导法转化水晶3号,... 详细信息

综合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因芯片技术,聚合主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1,以改良优良食味水稻品种水晶3号的稻瘟病抗性。首先利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以bsr-d1为靶基因构建重组表达载体并通过农杆菌介导法转化水晶3号,筛选获得无T-dNA元件的bsr-d1纯合突变体,包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5种突变类型。以无T-dNA成分的bsr-d1纯合突变体为母本、以携带Pigm基因的金玉1号为父本杂交、回交、自交,并利用分子育种芯片同时进行Pigm基因和背景辅助选择,最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合,且背景回复率均在96%以上的水晶3号改良株系(SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5)。稻瘟病抗性鉴定结果表明,各改良株系对稻瘟病生理小种GUY11的叶瘟抗性与野生型相比均显著提高;接种稻瘟病菌后,改良株系叶片中POd活性显著低于野生型对照,H_(2)O_(2)含量则显著高于野生型对照。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术结合基因芯片技术获得了同时携带bsr-d1和Pigm基因的抗稻瘟病水晶3号改良系。

关键词：水稻 Pigm bsr-d1 稻瘟病抗性 CRISPR/Cas9

中国部分水稻品种bsr-d1启动子稻瘟病持久抗性位点序列分析

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分子植物育种 2020年第13期18卷 4331-4337页

作者：刘畅媛孙一丁马继琼杨奕郭怡卿许明辉云南农业大学植保学院昆明650201 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所云南省农业生物技术重点实验室农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室昆明650205

为发掘稻瘟病种质资源持久抗性基因bsr-d1,本研究对来源中国的210份稻种bsr-d1基因启动子功能片段511个碱基序列进行了比对分析。结果发现品种间存在18个变异位点28个碱基的差异,根据差异所有品种可归为7种单倍型,其中H4和H6为优势单倍... 详细信息

为发掘稻瘟病种质资源持久抗性基因bsr-d1,本研究对来源中国的210份稻种bsr-d1基因启动子功能片段511个碱基序列进行了比对分析。结果发现品种间存在18个变异位点28个碱基的差异,根据差异所有品种可归为7种单倍型,其中H4和H6为优势单倍型,分别占测试品种70.48%和23.81%;云南地方品种拥有H1、H2、H3、H4、H5、H6等6种单倍型,优势单倍型为H4(51.95%)、H6(35.06%);选育品种有3种单倍型,分别为H4、H6、H7、H6为优势单倍型,地方品种单倍型较选育品种丰富。其他地区品种仅发现H4(1.52%)和H6(98.48%)2种单倍型,云南省单倍型更为多样丰富。7种单倍型中仅H1单倍型(占1.43%)携带抗性位点,仅3个云南地方品种出现该单倍型,说明中国地方品种和选育品种中均缺乏bsr-d1稻瘟病持久抗性基因。本研究结果为寻找和发掘持久抗稻瘟病基因bsr-d1提供了线索。

关键词：种质资源 bsr-d1 持久抗性单倍型

利用CRISPR/Cas9技术获得水稻恢复系bsr-d1基因突变体

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分子植物育种 2020年第16期18卷 5343-5350页

作者：卿冬进邓国富戴高兴高利军黄娟高菊潘英华周维永梁海福广西农业科学院广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室南宁530007 广西农业科学院南宁530007 广西农业科学院水稻研究所南宁530007

为研究水稻抗稻瘟病基因bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选... 详细信息

为研究水稻抗稻瘟病基因bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。

关键词：水稻稻瘟病 bsr-d1 基因编辑技术 CRISPR/Cas9

广谱抗稻瘟病基因bsr-d1在75份北方粳稻品种中的多态性分布与表达分析

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种子 2021年第11期40卷 113-116,131页

作者：陈晓军惠建马洪文白海波马静马斯霜李树华宁夏农林科学院农业生物技术研究中心银川750002 宁夏农林科学院农作物研究所银川750002

稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一,利用分子标记选育抗病品种是防治该病害最有效、最经济的方法。bsr-d1基因是对稻瘟病菌具有广谱抗性的一个重要基因。本研究利用PCR直接扩增的方法,研究广谱抗稻瘟病基因bsr-d1启动子的序列结构变异,... 详细信息

稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一,利用分子标记选育抗病品种是防治该病害最有效、最经济的方法。bsr-d1基因是对稻瘟病菌具有广谱抗性的一个重要基因。本研究利用PCR直接扩增的方法,研究广谱抗稻瘟病基因bsr-d1启动子的序列结构变异,同时验证其变异对靶基因的调控。结果表明,在75份北方粳稻品种中,仅有3份粳稻品种有bsr-d1基因的有利等位基因分布,此基因的突变降低过氧化物酶前体Os05g04470,Os10g39170基因的表达。

关键词：粳稻稻瘟病 bsr-d1 多态定量表达

水稻抗褐斑病品种资源筛选及广谱持久抗稻瘟病基因pi21和bsr-d1编辑材料的创建

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水稻抗褐斑病品种资源筛选及广谱持久抗稻瘟病基因pi21和bsr-d1编...

作者： Muhammad Usama Younas 扬州大学

学位级别：硕士

对于世界上不断增长的人口而言,水稻是最重要的口粮作物之一。人类消耗的大半卡路里源于诸如水稻、小麦和玉米等粮食作物。水稻是亚洲各国最重要的粮食作物,而诸如褐叶斑病、稻瘟病、白叶枯病等水稻病害引起的水稻减产是导致全球水稻产... 详细信息

对于世界上不断增长的人口而言,水稻是最重要的口粮作物之一。人类消耗的大半卡路里源于诸如水稻、小麦和玉米等粮食作物。水稻是亚洲各国最重要的粮食作物,而诸如褐叶斑病、稻瘟病、白叶枯病等水稻病害引起的水稻减产是导致全球水稻产量逐年减少的主要原因之一。由褐斑病菌引起的水稻褐叶斑病是水稻增产的主要制约因素之一,由于该病原菌能够通过空气传播并可潜伏于稻种中,导致褐叶斑病的蔓延十分迅速。对水稻生产威胁最大的病害是稻瘟病,而寻找并培育抗性品种是控制稻瘟病发生的最经济有效方式。本研究对25份水稻品种进行了水稻褐斑病抗性鉴定,并鉴定到多个含有2个稻瘟病抗性基因的水稻品种。主要结果如下:1)对来自巴基斯坦不同水稻种植区的25个不同水稻品种进行了褐叶斑病抗性鉴定,并测定了其叶绿素含量、株高、剑叶长、剑叶宽、穗长、穗数、颖花数和千粒重等农艺性状。抗性鉴定结果表明,没有品种对褐叶斑病存在免疫抗性,仅有2个品种(Winner和diamond 121)达到高抗水平,12个品种达到中抗水平,其余品种均中感或高感褐叶斑病。此外,25个品种的相关农艺性状存在较大差异,表明本研究所选取的水稻品种具有较好的多样性。相比于接种前,23个品种在接种后的各农艺性状均显著降低,而2个抗性品种在接种处理后的相关农艺性状表现良好,进一步表明了培育抗病品种的重要性。2)利用78个SSR标记对25个品种进行基因分型,其中53个SSR标记存在多态性,各标记包含的等位变异在2-4之间,平均为2.359个;多态性信息含量(PIC)在0.147～0.662之间,平均值为0.458利用上述标记的分型结果对25个品种进行聚类分析,发现这25个品种具有良好的遗传多样性。关联分析结果表明,6个SSR标记分别与穗数(RM1331)颖花数(RM3825、RM231)、株高(RM231)、剑叶长(RM267、RM424)和千粒重(RM561)显著相关,而标记RM542则与褐叶斑病发病率显著相关,且在该标记的3个等位变异中,含有等位变异ⅲ的品种的发病率显著高于含有其他2种等位变异的品种。这些相关标记位点上的优异等位变异可以进一步应用于相关性状的标记辅助育种中。3)在江苏著名商业化水稻品种南粳9108(NJ9108)背景下,利用CRISPR/Cas9技术,获得了含有广谱稻瘟病基因Pi2 1和bsr-d1的水稻品系。To代共获得25个转基因单株,经测序鉴定,有7个单株存在突变,其中,5个单株的bsr-d1发生突变,共计四种突变类型;2个单株的pi21发生突变,共计两种突变类型。通过加代后检测,最终在T1代获得了4种bsr-d1和3种pi21纯合敲除(NJ9108bsr-d1KO、NJ9108pi21KO)。进一步通过杂交,我们还获得了 4个双基因突变的F1单珠,后期将对上述转基因株系进行稻瘟病抗性鉴定。总的来说,本研究鉴定出两个高抗褐叶斑病的水稻品种,并创建了多个具有广谱抗稻瘟病基因的新品系,为后续的抗褐叶斑病基因挖掘及抗稻瘟病育种提供了益处。

关键词：水稻褐叶斑病稻瘟病 SSR标记 CRISPR/Cas9 pi21 bsr-d1

对水稻bsr-d1、PI21和OSERF922基因编辑改良LK638S抗病性

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对水稻BSR-D1、PI21和OSERF922基因编辑改良LK638S抗病性

作者：许世冲华中农业大学

学位级别：硕士

隆科638S(LK638S)属中籼型温敏核不育系,其育性稳定、配合力强,但LK638S抗病性水平较弱,影响杂交水稻组合的推广和应用。已有研究表明bsr-d1、Pi21和Os ERF922的功能缺失可以增强抗病性,因此本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术突变LK6... 详细信息

隆科638S(LK638S)属中籼型温敏核不育系,其育性稳定、配合力强,但LK638S抗病性水平较弱,影响杂交水稻组合的推广和应用。已有研究表明bsr-d1、Pi21和Os ERF922的功能缺失可以增强抗病性,因此本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术突变LK638S的bsr-d1、Pi21和Os ERF92基因,改良LK638S的抗病性。主要研究结果如下:(1)本试验设计了由水稻U3启动子驱动、长20bp的guide RNA(g RNA)靶点,分别靶向编辑bsr-d1第1、Pi21第2和Os ERF922第1外显子,构建单基因和三基因编辑载体。在T代阳性转基因植株中,bsr-d1、Pi21和Os ERF922的单基因编辑位点的突变率分别为82%、68%和73%,其中纯合突变分别有7株、15株和8株,纯合突变率分别为25%、33%和24%;bsr-d1、Pi21和Os ERF922三基因都为纯合突变有3株。T代不含Cas9转基因元件的单株突变类型与T代一致。(2)自然病圃鉴定结果表明,单基因纯合突变株系bsr-d1-9、bsr-d1-12、pi21-1、pi21-2、erf922-1、erf922-2和三基因纯合突变株系bsr-d1pi21erf922-1、bsr-d1pi21erf922-2的稻瘟病病斑面积与LK638S相比显著降低,并且erf922突变体和三基因缺失突变体病斑面积比bsr-d1和pi21突变体显著减少。人工接种稻瘟病菌株试验结果表明与LK638S相比,突变体株系的病斑面积显著减少,并且erf922-1和bsr-d1pi21erf922-1突变体的病斑面积显著低于bsr-d1-9和pi21-1,与自然病圃鉴定结果一致。(3)突变体bsr-d1-9和bsr-d1-12中过氧化氢酶基因LOC＿Os01g73170、LOC＿Os05g04470和LOC＿Os10g39170的表达量显著降低,H2O2的含量显著增加。接种稻瘟病菌后突变体中SA和JA信号通路中防御相关基因在接种稻瘟病菌种24h后的表达水平显著高于LK638S。(4)此外,本研究还利用6个白叶枯病菌株鉴定突变体对白叶枯病的抗性。与LK638S相比,pi21-1对Fu J、PXO99、PXO61和PXO71四个生理小种抗性显著增强;erf922-1对Fu J、PXO86、PXO61和PXO71四个生理小种抗性显著增强;bsr-d1-9对六个生理小种抗性均无显著变化。我们推测LK638S背景下敲除Pi21或Os ERF922基因可以提高LK638S对白叶枯病的抗性。基因表达分析显示接种白叶枯病菌72h后,pi21-1和erf922-1中SA和JA信号通路防御相关基因Os PR1a、Os PR1b、Os WRKY45和Os PR4表达均显著上调。这说明敲除Pi21或Os ERF922增强了LK638S对白叶枯病的抗性,这可能与SA和JA信号通路相关防卫基因的激活有关。(5)对LK638S与突变体的农艺性状考察结果显示,三基因敲出突变体bsr-d1pi21erf922-1的株高和分蘖数显著低于LK638S,穗长和穗粒数无显著差异。单基因敲除突变体bsr-d1-9、pi21-1和erf922-1的株高、分蘖、穗长和穗粒数与LK638S相比差异不显著。

关键词：水稻 CRISPR/Cas9 稻瘟病白叶枯病 Pi21 bsr-d1 OsERF922

水稻转录因子bsr-d1的表达纯化与晶体生长

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水稻转录因子BSR-D1的表达纯化与晶体生长

棉花四个C2H2锌指蛋白基因的克隆与表达分析

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：冀丽凤张鑫王冬立刘俊峰中国农业大学植物保护学院植物病理学系

由稻瘟菌引起的稻瘟病是水稻最严重的病害之一。非小种专化性抗性比小种专化性抗性更能有效地控制作物病害,因为它具有广谱性和持久性。水稻地谷中存在一种赋予稻瘟病非种族特异性抗性的CH型转录因子的天然等位基因bsr-d1。该等位基因... 详细信息

由稻瘟菌引起的稻瘟病是水稻最严重的病害之一。非小种专化性抗性比小种专化性抗性更能有效地控制作物病害,因为它具有广谱性和持久性。水稻地谷中存在一种赋予稻瘟病非种族特异性抗性的CH型转录因子的天然等位基因bsr-d1。该等位基因通过与抑制性MYB转录因子结合,导致bsr-d1基因表达量下降,抑制过氧化物酶表达,从而细胞内大量积累过氧化氢,因此增强水稻的抗病性。本研究通过原核表达系统、亲和层析和凝胶过滤层析等技术,获得了纯度较好的可溶性蛋白。目前作者已经通过坐滴气象扩散法对bsr-d1单体蛋白进行了大量晶体生长条件的筛选,以期获得蛋白晶体。另外,作者正在通过EMSA方法验证找出与bsr-d1有较强结合力的启动子区域,以期获得蛋白与核酸的复合物晶体结构。

关键词：转录因子 bsr-d1 启动子 EMSA 蛋白纯化晶体生长

来源： cnki会议评论

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分子植物育种 2021年第13期19卷 4216-4223页

作者：周垚均任艳萍代培红刘超刘晓东李月新疆农业大学农学院乌鲁木齐830001

水稻广谱抗病基因bsr-d1编码C2H2型锌指蛋白,本研究基于此通过RT-PCR技术从棉花中克隆4个与水稻bsr-d1同源的C2H2型锌指蛋白基因并对其进行了生物信息学分析和表达分析,结果表明这些基因氨基酸序列与bsr-d1的一致性为25%-35.7%,故命名为... 详细信息

水稻广谱抗病基因bsr-d1编码C2H2型锌指蛋白,本研究基于此通过RT-PCR技术从棉花中克隆4个与水稻bsr-d1同源的C2H2型锌指蛋白基因并对其进行了生物信息学分析和表达分析,结果表明这些基因氨基酸序列与bsr-d1的一致性为25%-35.7%,故命名为Ghbsr-d1L1-Ghbsr-d1L4;Ghbsr-d1Ls基因的开放阅读框大小为663-813 bp,编码的氨基酸数为220-270,蛋白质分子量为23.82-28.64 kd,理论等电点为7.22-8.56,不稳系数为47.7-67.17,亲水平均数为-0.755--0.544,无信号肽和跨膜结构域;Ghbsr-d1Ls均定位于细胞核,编码N端的保守L-box结构域,C2H2型锌指结构域以及C端的转录抑制结构域EAR/dLN-box,属于陆地棉中第Ⅱ类C2H2型锌指蛋白亚家族。系统发育树分析表明,Ghbsr-d1L1与Ghbsr-d3L3的遗传距离最近,Ghbsr-d1L2与大豆SCOF-1遗传距离最近,Ghbsr-d1L4与长果种黄麻的同源基因遗传距离最近。荧光定量PCR分析表明,Ghbsr-d1Ls基因在根、下胚轴及真叶中均表达,但表达量各有差异,同时在不同程度上Ghbsr-d1Ls均受到大丽轮枝菌的诱导。推测Ghbsr-d1Ls基因可能在棉花响应大丽轮枝菌时起重要作用。

关键词：棉花 bsr-d1 C2H2锌指蛋白基因克隆表达分析