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家蚕核型多角体病毒bro基因的单核苷多态性研究

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蚕业科学 2005年第3期31卷 294-299页

作者：王霞潘国庆庞敏李艳红周泽扬西南农业大学农业部蚕桑学重点开放实验室重庆师范大学生命科学学院重庆400047

bro(baculovirus repeated ORFs)基因家族是一类存在于核型多角体病毒中比较复杂的基因家族。家蚕核型多角体病毒T3BmNPV基因组中有5个bro基因,分别为bro-a,bro-b,bro-c,bro-d,bro-e。对我国的BmNPVCQ1株进行了全基因组测序,与T3序列比... 详细信息

bro(baculovirus repeated ORFs)基因家族是一类存在于核型多角体病毒中比较复杂的基因家族。家蚕核型多角体病毒T3BmNPV基因组中有5个bro基因,分别为bro-a,bro-b,bro-c,bro-d,bro-e。对我国的BmNPVCQ1株进行了全基因组测序,与T3序列比较发现两个差异较大区域,分别命名为V1,V2区。在此基础上,对来自国内不同地区的另外5株BmNPV分离株对应的差异区域进行了研究,克隆了包含15个bro基因的10个DNA片段,其中包含了5个bro-c基因序列,5个bro-d基因序列,4个bro-e基因序列,加上公共数据库中已有的2个bro-c、2个bro-d、1个bro-e,合并后对bro-c、bro-d、bro-e分别进行核苷酸多态性分析,结果表明bro-c、d、e类基因都存在高密度的SNP位点。出现在这3类基因中的单核苷酸位点或核苷酸片段的插入/缺失数目分别为9、1、1。(θ,π)分析表明bro-c类基因的多态性在3类bro基因中最高。Tajima’D检验结果说明这些核苷酸变化符合中性突变假说。Pi(a)/Pi(s)分析暗示bro-c,bro-d和bro-e的N端的一些区段受到正向选择。

关键词：家蚕核型多角体病毒 bro基因单核苷多态性插入/缺失 Tajima’D检验

儿童携带卡他莫拉菌的耐药性及bro基因分型研究

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实用儿科临床杂志 2005年第5期20卷 423-426页

作者：袁林杨永弘王艳张美和甄景慧沈叙庄首都医科大学附属北京儿童医院北京100045

目的对儿童携带214株卡他莫拉菌分离株产酶率和9种抗生素敏感性测定,研究产酶株β-内酰胺酶耐药基因特征。方法采用英国抗生素化疗学会(BSCA)琼脂稀释法进行抗生素最小抑菌浓度测定;用Nitrocefin纸片琼脂扩散法检测β- 内酰胺酶;PCR扩... 详细信息

目的对儿童携带214株卡他莫拉菌分离株产酶率和9种抗生素敏感性测定,研究产酶株β-内酰胺酶耐药基因特征。方法采用英国抗生素化疗学会(BSCA)琼脂稀释法进行抗生素最小抑菌浓度测定;用Nitrocefin纸片琼脂扩散法检测β- 内酰胺酶;PCR扩增结合限制性内切酶分析方法对分离株进行bro基因分型。结果214株卡他莫拉菌中β-内酰胺酶产酶率为94.4%。产酶株对β-内酰胺类抗生素:氨苄西林、头孢呋辛、头孢克洛的MlC90分别为32 mg/L、2 mg/L和8 nag/L,明显高于非产酶株的0.5 mg/L,10 mg/L和0.5 mg/L;产酶株对氨苄西林、头孢呋辛、头孢克洛耐药率分别为95%、46.5%和76 2%,明显高于非产酶株组(0%)(x2=100.889,8.159,28.961 P均bro基因分型,69.8%(141/ 202)为bro—Ⅰ型,30.2%(61/202)为bro-Ⅱ型。bro-Ⅰ型携带菌株对β-内酰胺类抗生素的MIC50和MIC90高于bro-Ⅱ型的耐药株。结论北京地区携带的卡他莫拉菌β-内酰胺酶产酶率较高。

关键词：卡他莫拉菌抗生素耐药 bro基因

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒3个bro基因的原核表达与抗体制备

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中国病毒学 2003年第6期18卷 597-602页

作者：陈明明吴东袁丽陈新文胡志红中国科学院武汉病毒研究所无脊椎动物病毒学联合开放实验室湖北武汉430071 中国科学院武汉病毒研究所分子病毒学重点实验室湖北武汉430071

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)基因组全序列,设计引物,用PCR的方法扩增得到bro-a、bro-b和bro-c三个全长基因。将这三个基因的片段分别克隆至原核表达载体pProExHTb,经IPTG诱导,在*** DH50菌株中得到了目的基因的高效表达。... 详细信息

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)基因组全序列,设计引物,用PCR的方法扩增得到bro-a、bro-b和bro-c三个全长基因。将这三个基因的片段分别克隆至原核表达载体pProExHTb,经IPTG诱导,在*** DH50菌株中得到了目的基因的高效表达。表达的目的蛋白大小分别为32kDa、64kDa和58kDa,经SDS-PAGE分离纯化,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。抗体经1∶2500倍稀释后用于WestemBlot分析,获得特异性显色信号,所制备的三种抗体适合用作bro基因的功能的进一步研究。

关键词：棉铃虫单核衣壳核多角体病毒克隆表达抗体 bro基因

急性下呼吸道感染患儿卡他莫拉菌耐药性与bro基因分型研究

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中国实用儿科杂志 2009年第8期24卷 606-609页

作者：车大钿张泓陆权张育才陆敏李万华上海交通大学附属儿童医院上海200040

目的探讨上海地区急性下呼吸道感染患儿卡他莫拉菌分离株产酶率和耐药情况,研究产β内酰胺酶株耐药基因特征。方法对2007年1—12月上海交通大学附属儿童医院收治的下呼吸道分泌物卡他莫拉菌培养阳性的28例患儿,采用琼脂稀释法进行抗生... 详细信息

目的探讨上海地区急性下呼吸道感染患儿卡他莫拉菌分离株产酶率和耐药情况,研究产β内酰胺酶株耐药基因特征。方法对2007年1—12月上海交通大学附属儿童医院收治的下呼吸道分泌物卡他莫拉菌培养阳性的28例患儿,采用琼脂稀释法进行抗生素最低抑菌浓度测定;用Nitrocefin纸片法检测β内酰胺酶;PCR扩增结合限制性内切酶分析方法对分离株进行bro基因分型。将bro-1基因阳性和bro-2基因阳性菌株对β内酰胺类抗生素的耐药性进行比较。结果(1)28株卡他莫拉菌中β内酰胺酶产酶率为100%。产酶株对孢呋辛、头孢克洛、头孢曲松的MIC90值分别为4、8、0.5mg/L;对克林霉素及阿奇霉素的MIC90值均为64mg/L,左氧氟沙星是最敏感的抗生素。(2)bro基因分型结果:27株为bro-1型,仅1株为bro-2型。(3)β内酰胺类抗生素对bro-1型携带菌株的MIC50和MIC90值明显高于bro-2型耐药株。结论上海地区急性下呼吸道感染患儿卡他莫拉菌分离株呈高产β内酰胺酶,以携带bro-1基因为主,而β内酰胺类抗生素对bro-1型携带菌株的MIC50值明显高于bro-2型耐药株。

关键词：卡他莫拉菌耐药 B内酰胺酶 bro基因

家蚕核型多角体病毒广东分离株空斑克隆株系的建立及其bro基因家族的分析

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家蚕核型多角体病毒广东分离株空斑克隆株系的建立及其bro基因家...

作者：庞敏西南大学

学位级别：硕士

通过比较NCBI数据库中BmNPV T3株和SC7株的序列得知，不同地区的BmNPV基因组序列存在一定差异，并且大的差异主要位于bro（baculovirus repeated open reading frames）基因家族所在的区域。bro家族是一类在昆虫杆状病毒科中出现的多基... 详细信息

通过比较NCBI数据库中BmNPV T3株和SC7株的序列得知，不同地区的BmNPV基因组序列存在一定差异，并且大的差异主要位于bro（baculovirus repeated open reading frames）基因家族所在的区域。bro家族是一类在昆虫杆状病毒科中出现的多基因家族，在不同的病毒株中有不同的拷贝，且在碱基序列上也有明显不同。近年来，有关BmNPV bro基因的研究较多，学者们认为bro基因在病毒侵染宿主的过程中具有一定的功能。BmNPV T3株基因组中存在bro-a，bro-b，bro-c，bro-d，bro-e 5个拷贝，它们分布于基因组的三个区域。我们研究发现，BmNPV CQ1株在基因组的第二个区域缺失bro-b基因，GD株在基因组的第三个区域缺失bro-e基因。本研究以BmNPV GD株为研究材料，对其进行了空斑纯化，并对其bro基因家族进行了克隆分析，对bro基因的功能和进化进行了探讨。 *** GD分离株空斑克隆株系的建立及验证以家蚕胚胎细胞系（BmE-SWU1）为病毒培养载体，利用中性红染色的方法对BmNPV GD株进行了空斑克隆，经扩大培养，获得GD株空斑克隆株系。根据BmNPV CQ1株基因组序列的单核苷酸多态性分析，选出其中SNP位点较多的gcn2（General Control Nonderepressible2）基因，用于验证BmNPV GD株空斑克隆株系的纯粹性。分别从BmNPV GD株和空斑克隆株的基因组中扩增gcn2基因，经T-克隆后测序;将两株病毒的gcn2基因分别进行单核苷酸多态性（SNP）位点分析，发现GD株gcn2基因的潜在SNP位点有2个，而空斑克隆后的病毒株5条gcn2基因序列比较后则未发现多态性位点，说明空斑克隆株经纯化后，病原基因组的纯粹性得到提高，病原得到了纯化。 ***基因的同源性分析分析bro基因在各病毒株基因组中的分布情况，bro基因主要分布在基因组的三个区域，以T3基因组的bro分布为标准，CQ1株在第二个区域缺失bro-b基因，GD株在第三个区域缺失bro-e基因，而bro-d基因在几株病毒中都存在。以BmNPVGD株空斑克隆株的基因组为模板，扩增出bro-a，RegionⅡ（主要包括bro-b和bro-c基因），bro-d三个片段。与GenBank数据库中BmNPV bro基因序列及本实验室测定的CQ1株的bro基因序列进行比较分析，结果表明BmNPV GD株bro基因存在插入及缺失，bro基因同源性较高，差异主要集中在其氨基酸序列的N端部分。经ANTHEPRO5.0软件预测GD株bro蛋白均无跨膜区和信号肽。 ***基因的系统发育分析与功能分析采用邻接法进行的bro基因的系统发育分析表明，GD株bro基因分别位于3个亚组中，GD株bro-d与日本T3株、重庆CQ1株bro-d以及法国SC7株bro-Ⅲ属于亚组A;其bro-a,c与T3株、CQ1株bro-a,c以及SC7株bro-Ⅱ属于亚组B;其bro-b与T3株、CQ1株bro-b,e以及SC7株bro-Ⅰ属于亚组C，C亚组的bro基因与A亚组和B亚组的bro基因具有较大的进化分歧，bro基因进化与地理位置的相关性不明显。根据bro基因在四个不同株系基因组中的位置特征，进一步支持了Kang等的观点：bro-d是BmNPV生存所必需的，bro-a和bro-c相互间功能互补。同时推测bro-b和bro-e功能可能是互补或相同，SC7株的3个bro基因可能是BrnNPV bro家族出现的最简约形式。另外，GD株bro蛋白N端序列符合前人发现的保守序列模式，但也发现其C端也是高度保守的。在GD株和CQ1株的bro基因中都发现了早期基因启动子结构域C（T）AGT，说明bro基因在病毒感染早期表达。

关键词： BmNPV 空斑克隆 bro基因系统发育地理分布

家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bro基因的遗传多样性和进化分析

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家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bro基因的遗传多样性和进化分析

作者：王霞西南农业大学

学位级别：硕士

本实验室完成了BmNPV CQ1株的基因组测序,将其基因组序列与NCBI上公布的BmNPV T3株的基因组序列进行比较,发现两者之间存在两个主要的差异区域,分别称为V1、V2区。V1区位于T3基因组中的第76 031bp-78 388bp(共2358bp),V2区位于T3基因组... 详细信息

本实验室完成了BmNPV CQ1株的基因组测序,将其基因组序列与NCBI上公布的BmNPV T3株的基因组序列进行比较,发现两者之间存在两个主要的差异区域,分别称为V1、V2区。V1区位于T3基因组中的第76 031bp-78 388bp(共2358bp),V2区位于T3基因组的第125 542 bp-127 075 bp(共1534bp),V1、V2区主要包括的是bro基因。收集重庆病毒株CQ2、四川病毒株SC、江苏病毒株JS和广东株病毒株GD。分别以它们的基因组为模板扩增对应于T3株的V1、V2区,通过克隆、测序得到这些V1、V2区的序列信息。结合NCBI上公布的BmNPV-T3与-SC7两株病毒的bro基因的序列信息进行bro基因的遗传多样性和进化分析,其主要结果如下: ***基因在各BmNPV株基因组中的分布采用DNAstar软件包分析bro基因在各BmNPV株基因组中的分布。在所分析的7株病毒株中,bro基因分布在基因组的三个区域,bro基因的拷贝数存在差异。T3株基因组中存在bro-a,bro-b,bro-c,bro-d,bro-e 5个拷贝,它们分布于基因组的三个区域,其中bro-a单独存在于基因组的一个区域,bro-b和bro-c,bro-d和bro-e分别以两两串联的方式存在于基因组的另外两个区域。以T3株bro基因的分布为参照,在bro基因分布的第二个区域,CQ1、CQ2、SC、JS株缺失一个bro-b基因;在bro基因分布的第三个区域,GD株缺失一个bro-e基因。 ***基因的系统发育分析对所获得的24个bro基因采用邻接法进行系统发育分析。在构建的系统发育树中主要有三个大的分支,bro-d基因在一个分支上,属于A亚组;bro-a和bro-c在一个分支上,属于B亚组;bro-d和bro-e在一个分支上,属于C亚组。这与Kang等的结果保持一致。C亚组的bro基因与A亚组和B亚组的bro基因具有较大的进化分歧。 ***基因的多态性分析本研究用DnaSP软件包对不同地区BmNPV株bro-c,d,e基因的多态性进行分析。结果表明bro-c,d,e基因都存在高密度的SNP位点。出现在这三类基因中的单核苷酸位点或核苷酸片段的插入/缺失数目分别为9,1,1。(θ,π)分析表明bro-c基因的多态性在三类bro基因中最高。Tajima'D统计学检验结果是各类bro基因多态性都不显著,暗示它们的核苷酸变化符合中性突变假说。bro-c、bro-d和bro-e这三类基因的dN/dS值分别为0.347、0.369、0.228,说明它们整体受到了负向选择。从Sliding-window分析可以看出,bro-c、bro-d和bro-e的大部分位点Pi(a)/Pi(s)值(一种dN/dS的动态估算方法)都小于1,但是它们分别在121-150bp、100-147bp、208-255bp这些区段存在Pi(a)/Pi(s)值大于1的位点,表明bro基因N端的某些位点受到了正向选择,而这些基因整体受到负向选择的作用。 ***蛋白单个密码子受到的选择压力分析

关键词： BmNPV bro基因遗传多样性进化

家蚕核型多角体病毒泰国株的鉴定及其bro基因家族分析

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家蚕核型多角体病毒泰国株的鉴定及其bro基因家族分析

作者：周敬波安徽农业大学

学位级别：硕士

BmNPV为环状双链DNA病毒，属杆状病毒科，核型多角体病毒属，主要感染家蚕，严重影响蚕茧的质量与产量，给养蚕生产带来了巨大的经济损失。bro基因家族是一类在昆虫杆状病毒科中出现的多基因家族，在不同的病毒株中有不同的拷贝，且在... 详细信息

BmNPV为环状双链DNA病毒，属杆状病毒科，核型多角体病毒属，主要感染家蚕，严重影响蚕茧的质量与产量，给养蚕生产带来了巨大的经济损失。bro基因家族是一类在昆虫杆状病毒科中出现的多基因家族，在不同的病毒株中有不同的拷贝，且在碱基序列上也有明显不同。近年来，研究发现，bro基因在病毒侵染宿主的过程中具有一定的功能。通过比较NCBI数据库中现有BmNPV不同株系的序列得知，不同地区的BmNPV基因组序列存在一定差异，并且bro基因家族所在的区域存在较大的差异。BmNPV T3株基因组中存在bro-a、bro-b、bro-c、bro-d、bro-e5个拷贝，分布于基因组的三个区域。本研究以BmNPV泰国株为研究材料，对其进行了鉴定分析，并对其bro基因家族进行了测序比对分析，对bro基因的功能和进化进行了初步探讨。 1. BmNPV泰国株的分离纯化及鉴定分析本实验室与泰国Mahasarakham大学合作从泰国家蚕品种（Nanglai）中分离纯化得到一种家蚕NPV病毒，暂定名为BmNPV-Thai。通过对BmNPV泰国株的几个保守基因（p10、p35、polh、egt、vp39）进行了克隆测序与比对分析，鉴定该病毒为一种新的BmNPV病毒株。 2. bro基因的同源性分析以BmNPV泰国株的基因组为模板，PCR扩增出了bro-a，bro-c，bro-d三个基因片段。在BmNPV中，bro基因主要分布在基因组的三个区域，以T3基因组的bro基因分布为标准，CQ1株在第二个区域缺失bro-b基因，GD株在第三个区域缺失bro-e基因，泰国株在第二和第三个区域中同时缺失了bro-b、bro-e基因，而bro-d基因在几株病毒中都存在。与NCBI数据库中BmNPV bro基因序列进行比对分析，结果表明BmNPV泰国株bro基因存在较多的插入及缺失，不同株系对应bro基因之间同源性较高，差异主要集中在其氨基酸序列的N端部分。泰国株bro蛋白的N端序列符合Zemskov等分析发现的与DNA连接相关的保守序列模式，经ANTHEPRO5.O软件预测泰国株bro蛋白均无跨膜区和信号肽。 3. bro基因的系统发育分析从邻接法（Neighbor-Joining）构建的bro基因系统发育树中可以看出，泰国株的3个bro基因分别存在于2个亚组中，泰国株bro-d与T3、CQ1、GD株bro-d以及SC7株bro-III属于A亚组，泰国株bro-a，bro-c与T3、CQ1、GD株bro-a，bro-c以及SC7株bro-II属于B亚组，但是泰国株在C亚组中没有出现对应的bro基因。bro-a和bro-c组成的B亚组与bro-d所在的A亚组进化关系较近，而后再与bro-b和bro-e组成的C亚组相聚，bro基因进化与地理位置的相关性不明显。根据bro基因在不同株系基因组中的位置分布特征，进一步支持了Kang等的观点：bro-d是BmNPV生存所必需的，bro-a和bro-c相互间功能互补。就现在的研究结果而言，bro基因家族在BmNPV中的最简约形式还不能确定，还有待进一步的探索研究。通过保守基因及bro基因家族的序列分析，鉴定了一个新的病毒株，分析了该病毒株bro基因的系统进化。通过不同地域的病毒株的系统进化分析，为进一步研究NPV病毒对家蚕的感染机制作出了贡献。

关键词： BmNPV 鉴定分析 bro基因系统发育地理分布

山东临沂地区下呼吸道感染患者卡他布兰汉菌耐药性分析及bro基因分型检测

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中华临床感染病杂志 2015年第3期8卷 253-257页

作者：孙淑红张伟胡晓峰凌宗欣朱德全山东省临沂市人民医院检验科 276003 山东省临沂市人民医院康复科 276003 浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室感染性疾病诊治协同创新中心

目的：分析山东临沂地区下呼吸道感染患者痰液样本中分离的卡他布兰汉菌对常用抗菌药物的耐药性及bro基因分型对耐药性的影响。方法连续收集2010年1月至2014年12月山东省临沂市人民医院镜检合格的下呼吸道感染患者痰液样本，将其分别划... 详细信息

目的：分析山东临沂地区下呼吸道感染患者痰液样本中分离的卡他布兰汉菌对常用抗菌药物的耐药性及bro基因分型对耐药性的影响。方法连续收集2010年1月至2014年12月山东省临沂市人民医院镜检合格的下呼吸道感染患者痰液样本，将其分别划线接种于4块不同琼脂培养基进行细菌分离培养及鉴定。对分离出的卡他布兰汉菌进行药敏试验和β-内酰胺酶检测，同时采用PCR扩增结合限制性内切酶分析法对分离株进行bro基因分型。采用χ^2检验比较不同bro基因型菌株对抗菌药物的耐药率。结果5年来共分离出497株卡他布兰汉菌，以冬季检出最多（共221株）。所有菌株对厄他培南和氯霉素完全敏感，对阿莫西林／克拉维酸和头孢呋辛耐药率较低（≤2.8％），对复方磺胺甲噁唑、红霉素和氨苄西林的耐药率较高，为47．6％-89．8％，且呈逐年增加趋势，但差异无统计学意义（P＞0．05）。共检出产β-内酰胺酶卡他布兰汉菌412株（412／497，82．9％），均为bro基因阳性菌株，bro基因阳性菌株对红霉素、复方磺胺甲噁唑、左氧氟沙星和氨苄西林的耐药率均高于bro阴性菌株（χ^2＝12．16、16．18、8．41和200．00，P＜0．05）。经bro基因分型发现，bro-1型菌株占94．9％（391／412），bro-2型菌株占5.1％（21／412），bro-1型与bro-2型菌株对常用抗菌药物的耐药率差异无统计学意义（P＞0．05）。结论临床分离卡他布兰汉菌产β-内酰胺酶阳性率较高，且多为bro-1型阳性株。菌株对碳青霉烯类抗菌药物、头孢菌素及β-内酰胺酶抑制剂敏感率较高，可作为治疗呼吸道卡他布兰汉菌感染的首选。

关键词：呼吸道感染卡他布兰汉菌 β-内酰胺酶类微生物敏感性试验 bro基因

棉铃虫核型多角体病毒Ha105的序列分析及敲除和回复菌株的构建

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生物技术通报 2011年第7期27卷 134-138页

作者：曾利平闫尧徐旭士江苏省生物多样性与生物技术重点实验室南京师范大学生命科学学院南京210046

通过生物信息学方法对Ha105的生物功能进行预测,运用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有350 bp同源臂的氯霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因替换了棉铃虫病毒细菌人工染色体HaBacHZ8上的Ha105基因,然后利用Bac... 详细信息

通过生物信息学方法对Ha105的生物功能进行预测,运用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有350 bp同源臂的氯霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因替换了棉铃虫病毒细菌人工染色体HaBacHZ8上的Ha105基因,然后利用Bac-to-Bac系统把Ha105回复到Ha105缺失的重组病毒上,构建了Ha105的缺失和回复重组病毒。生物信息学分析结果表明,Ha105是bro基因家族成员,含有bro-N结构域,可能对宿主细胞的转录和病毒复制有一定影响。此外,重组病毒的PCR及酶切结果表明,成功构建了vHaHa105-KO-PH-gfp缺失菌株和vHaHa105-REP-PH-gfp、vHaHa105-REP-gfp回复菌株。该Ha105缺失及回复菌株的获得为进一步研究Ha105的功能奠定基础。

关键词：棉铃虫核型多角体病毒 bro基因基因敲除 Red-ET重组 Bac-to-Bac昆虫表达系统